強(qiáng)力霉素單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、強(qiáng)力霉素(Doxycycline，DC)為四環(huán)素類抗生素，被廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于大量的使用和不遵守休藥期，造成其在動(dòng)物組織中的殘留。人食用動(dòng)物產(chǎn)品后，抗生素會(huì)在人體內(nèi)蓄積，對(duì)人體健康造成威脅。我國出口的水產(chǎn)品，也因抗菌藥物超標(biāo)的問題，而多次遭到歐盟、美國、日本等國家的抵制。因此有必要建立高效準(zhǔn)確的檢測方法，加強(qiáng)強(qiáng)力霉素殘留的監(jiān)測力度。
　　 本研究主要內(nèi)容有：DC人工抗原的合成，DC多克隆抗體、單克

2、隆抗體的制備及特性測定，ciELISA方法的建立及其性能測定，蛋白芯片檢測方法的初步建立。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.免疫原和包被原的合成與鑒定
　　 采用改進(jìn)碳二亞胺法合成免疫原(DC-BSA)和包被原(DC-OVA)，通過紫外光譜掃描法進(jìn)行鑒定，證明人工抗原合成成功，DC與BSA偶聯(lián)比為3:1。以DC-BSA免疫BALB/C小鼠，獲得的血清多抗用ELISA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示小鼠免疫獲得了較高效價(jià)、敏感、特異性的

3、抗血清，進(jìn)一步證明人工抗原偶聯(lián)成功。
　　 2.抗DC單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性的鑒定
　　 用DC-BSA免疫BALB/C小鼠，選擇免疫效果最好的小鼠作為脾細(xì)胞制備鼠，應(yīng)用小鼠實(shí)體瘤制備小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞，脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞在PEG-4000的作用下進(jìn)行融合，采用間接ELISA和間接競爭ELISA法對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)測定，篩選陽性細(xì)胞，并對(duì)陽性細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)行克隆，最后篩選出1株雜交瘤細(xì)胞3D1

4、-H4。采用體內(nèi)誘生法制備含單克隆抗體的腹水，并用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化。間接ELISA法測得雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和單抗腹水效價(jià)分別為1:8×102和1:5.12×105。間接競爭ELISA法測得單抗IC50為44.46 ng/mL，與四環(huán)素、土霉素和金霉素分別有8.87%、5.86%和2.74%的交叉反應(yīng)率。經(jīng)鑒定獲得的單抗為IgGl型免疫球蛋白。
　　 3.ELISA方法建立及性能測定
　　 應(yīng)用獲得的單克隆抗體建立了

5、水產(chǎn)品中DC殘留的間接競爭ELISA檢測方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線呈典型的S型，回歸方程為y=-0.3591x+1.0602，相關(guān)系數(shù)R2=0.9919，線性范圍為1.58～199.53 ng/mL，對(duì)DC的IC50為36.31 ng/mL，最低檢測限為2.88ng/mL。以斑點(diǎn)叉尾鮰組織樣品為檢測對(duì)象，在5、25、50 ng/mL的添加水平下，斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉樣品的回收率為80.88%～90.72%，肝臟樣品的回收率為76.40%～84.56%，平

6、均批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于15%，基質(zhì)影響效應(yīng)小。表明建立的間接競爭ELISA方法能夠滿足水產(chǎn)品中DC的殘留檢測。
　　 4.蛋白芯片檢測方法的建立
　　 以高分子三維基片為載體，DC-OVA為捕獲抗原，強(qiáng)力霉素單克隆抗體為一抗，熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，構(gòu)建了強(qiáng)力霉素殘留的蛋白芯片檢測方法，并對(duì)蛋白芯片的制備、反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明合適的點(diǎn)樣濃度為0.5 mg/mL，封閉液為0.1 mol/L Tris溶液，一