抗卡那霉素單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、卡那霉素屬于氨基糖苷類抗生素的一種，其被廣泛添加到動物飼料中，以防止動物機體受到細菌的感染。但是不遵守休藥期規(guī)定及不合理的用藥等情況，都會造成卡那霉素在動物組織中的殘留。如果人類長期攝取含有卡那霉素殘留的食品，將會對人體造成嚴重的耳毒性或腎毒性損害。所以建立ELISA檢測方法來檢測卡那霉素在動物源性食品中的殘留是十分必要的。制備卡那霉素完全抗原及抗卡那霉素單克隆抗體是ELISA檢測方法建立的核心步驟，直接關系到檢測結果的敏感性及準確度。

2、
　　本實驗分析了卡那霉素的結構特性及免疫學特性，用兩種方法制備了卡那霉素人工抗原，并對制備結果進行了鑒定;用雜交瘤技術制備了抗卡那霉素單克隆抗體，并對其免疫學特性進行鑒定。以上工作為動物源性食品中卡那霉素殘留的免疫學快速檢測方法建立奠定了堅實的基礎。本實驗研究內(nèi)容具體如下:
　　1、卡那霉素人工抗原的制備及鑒定。
　　將卡那霉素標準品與牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，制備人工抗原。利用兩種不同的偶聯(lián)

3、方法:碳二亞胺法(EDC)和戊二醛法(GDA)，分別制備出KAN-BSA（作為免疫原），KAN-GDA-OVA（作為包被原）。利用SDS-PAGE凝膠電泳和動物免疫試驗，鑒定了完全抗原偶聯(lián)情況。結果顯示:偶聯(lián)物的蛋白條帶相比載體蛋白的條帶有明顯的滯后性;制備的卡那霉素完全抗原能刺激小鼠機體產(chǎn)生相應抗體，且抗血清效價均達到1∶2.56×104，其中1號小鼠的IC50值為22.28ng/mL，說明完全抗原免疫原性良好，抗原制備成功。

4、　　2、抗卡那霉素單克隆抗體的制備及鑒定。
　　利用細胞融合技術，將1號小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞NS0在PEG的作用下融合，制備雜交瘤細胞。利用間接ELISA及間接競爭ELISA的方法篩選陽性克隆。選擇能穩(wěn)定傳代的陽性雜交瘤細胞株，用有限稀釋法對其進行克隆化，經(jīng)過三次亞克隆，得到2株能穩(wěn)定分泌抗卡那霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞——1E1、2B12，并將其擴大培養(yǎng)，及時凍存。
　　采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體。用棋盤

5、法做間接ELISA試驗，進行最佳包被濃度的選擇，結果顯示包被原KAN-GDA-OVA的最佳工作濃度為2.5μg/mL。用最佳包被濃度包被酶標板，采用間接EHSA及間接競爭ELISA的方法測定制備的抗卡那霉素單克隆抗體的效價及敏感性，并根據(jù)間接競爭ELISA的數(shù)據(jù)結果對1E1進行標準曲線的繪制，得到回歸方程y=-0.3793x+0.8084，IC50為6.5024ng/mL。
　　最后對所制備的抗卡那霉素單克隆抗體進行一系列的特性鑒