抗狂犬病病毒單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患的烈性傳染病,也是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病?？箍袢〔《締慰寺】贵w是研究狂犬病病毒診斷方法、治療及預防狂犬病的有力工具。為了獲得高效價、高特異性的抗狂犬病病毒的單克隆抗體,進而將其應用于開發(fā)一種方便、簡單、廉價、技術要求低且適合基層使用的診斷方法,本研究用人用狂犬疫苗免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術制備得到針對狂犬病病毒的穩(wěn)定的、效價高的、特異性強的單克隆抗體(mAb),并初步鑒定了雜交瘤

2、和mAb的生物學特性,包括:雜交瘤的染色體、雜交瘤分泌抗體的穩(wěn)定性、mAb的效價、亞類、純度、蛋白濃度以及mAb的特異性。為開發(fā)簡單實用的檢測方法打下基礎。
　　 一、融合條件的摸索
　　 在充分了解SP2/0細胞系的生長、增殖和遺傳特性后,以聚乙二醇(PEG)誘導動物細胞融合,探索不同分子量、不同濃度的PEG作為融合劑對誘導SP2/0細胞與脾細胞融合的最適條件。結果表明分子量為4000,濃度為50％的PEG誘導的細胞融

3、合率最高,為0.06429％,為下一步制備單克隆抗體奠定基礎。
　　 二、單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備、篩選、克隆、穩(wěn)定性及染色體
　　 1.抗體制備與細胞融合
　　 使用人用狂犬疫苗免疫雌性BALB/c小鼠,間隔2周免疫1次。雙方陣法確定了間接ELISA法的最佳抗原包被濃度為1∶80,陽性血清最適工作稀釋度為1∶400。間接ELISA法檢測抗體效價達到104的3d后,通過PEG4000使免疫B淋巴細胞和小鼠骨髓

4、瘤細胞SP2/0融合。融合3-5d后出現雜交瘤細胞,7-10d后觀察到雜交瘤細胞克隆生長。經HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)后,細胞的融合率為82.99％。
　　 2.陽性克隆的篩選
　　 融合后14d左右,融合的雜交瘤細胞長到大約培養(yǎng)板的1/2面積時,按照已建立的間接ELISA法進行篩選,陽性克隆率為15.90％(38/239),選擇OD值比較高的14株陽性雜交瘤細胞株進行亞克隆。
　　 3.陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)

5、r>　　 用顯微操作法對陽性克隆的細胞株,分別進行了亞克隆,得到17珠分泌抗狂犬病病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名8F3、8F4、8G8、17A4、17A5、17A7、1782、1785、1784、17C2、17C6、17D2、17D4、17D8、17E3、17E4、17F3。選擇OD450值較高,生長狀態(tài)良好的8F3、8F4、8G8、17B2、17E3、17E4、17F3進行擴大培養(yǎng)和鑒定,其它株冷凍保存。
　　 4.

6、抗體分泌的穩(wěn)定性檢測
　　 將雜交瘤細胞連續(xù)培養(yǎng)傳代,共傳18代每隔3代檢測一次細胞培養(yǎng)上清的抗體效價,結果顯示6代以后雜交瘤進入穩(wěn)定分泌抗體時期。
　　 5.雜交瘤細胞的染色體計數
　　 雜交瘤細胞染色體的平均數為94條,符合融合細胞染色體的特點。
　　 三、單克隆抗體的制備及初步鑒定
　　 1.mAb的制備
　　 通過收集培養(yǎng)上清、體內誘生腹水、制備實體瘤分離血清法獲得并保存了8F3、

7、8F4、8G8、17B2、17E3、17E4和17F3分泌的抗體。
　　 2.mAb的純化
　　 經抗體亞類初步鑒定8F3、8F4、8G8、1782、17E3、17E4、17F3所分泌的抗體類型皆屬于IgG亞類,采用辛酸-硫酸銨法進行純化。
　　 3.mAb的效價
　　 間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清、純化和未純化的腹水和實體瘤血清抗體效價。腹水和實體瘤血清中的抗體效價均高于104,最高的達1∶128000

8、,且腹水和實體瘤血清的效價比同種單抗細胞培養(yǎng)上清的效價均高100倍以上。
　　 4.mAb的亞類
　　 Ig類及亞類的鑒定結果顯示8F3和8F4屬于IgG2b,8G8和17E4屬于IgG3、17B2屬于IgG1,17E3和17F3屬于IgG2a。
　　 5.mAb的純度
　　 純化后的單抗在50kD和25kD附近出現兩條帶,與預期的IgG抗體重鏈和輕鏈條帶大小相符,而未純化的單抗泳道上則出現多條雜帶。

9、r>　　 6.mAb的蛋白濃度
　　 紫外分光光度法測得17B2、17E3、17E4、17F3、8F3、8F4、8G8、濃度分別為:1.6565mg/mL、0.0162mg/mL、0.0163mg/mL、1.7120mg/mL、1.6315mg/mL、1.6834mg/mL、0.0163mg/mL。
　　 7.mAb的特異性
　　 7株單克隆抗體與三個廠家的狂犬疫苗反應均為陽性,與犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬傳染