狂犬病病毒N和G蛋白多克隆抗體的制備.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起的人畜共患病急性傳染病。人被RV感染后,一旦出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,幾乎百分之百死亡,我國(guó)每年超過(guò)1000人死于狂犬病?？梢?jiàn),狂犬病嚴(yán)重威脅人類的健康。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的廣泛應(yīng)用,對(duì)RV各蛋白的功能、致病機(jī)制、出芽過(guò)程的研究取得巨大進(jìn)展,但依舊沒(méi)有完全透徹。透徹研究這些機(jī)制,將有助于治療狂犬病藥物的開(kāi)發(fā)和免疫疫苗質(zhì)量的提高。目前,由于缺乏適用的RV單克隆或多克隆抗體,嚴(yán)重

2、阻礙了我們研究的步伐,適用抗體的研制已成為相關(guān)研究的前提條件。核蛋白(N)蛋白對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制至關(guān)重要,制備N蛋白抗體用于檢測(cè) N蛋白表達(dá)量,繼而評(píng)價(jià)病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制能力。糖蛋白(G)是RV的主要保護(hù)性抗原,同時(shí)它還與病毒的嗜神經(jīng)性、致病性密切相關(guān),所以制備適用的G蛋白抗體十分必要。
　　N蛋白的主要線性抗原結(jié)構(gòu)區(qū)域位于360-383位氨基酸殘基。本文以 RC-HL N基因質(zhì)粒為模板,利用兩對(duì)引物 RV-NF1/R1、RV-NF2/

3、R2分別擴(kuò)增N1-2(350-410位氨基酸)、N3-4(360-451位氨基酸)兩個(gè)片段。再利用RV-NF1和RV-NR2兩條末端互補(bǔ)的引物和N1-2、N3-4片段膠回收產(chǎn)物進(jìn)行重疊PCR,擴(kuò)增出N1-4片段。并將其克隆至 pMD18-T載體得到 pMD-N1-4質(zhì)粒,雙酶切后亞克隆到 pET-32a原核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化宿主菌Rosetta并利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),SDS-PAGE分析重組N蛋白,發(fā)現(xiàn)主要以包涵體形式表達(dá)。重組N蛋白經(jīng)

4、Ni-NTA親和層析配合含不同濃度尿素的包涵體洗滌液進(jìn)行純化。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行梯度透析,使其復(fù)性重折疊。復(fù)性蛋白配合弗氏佐劑按照合理的免疫程序進(jìn)行小鼠免疫,采集血清制備多克隆抗體。Western blot檢測(cè)感染RC-HL48h的BHK細(xì)胞中N蛋白的表達(dá),出現(xiàn)50.5 kd的目的條帶;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗體能和N蛋白發(fā)生良好反應(yīng),檢測(cè)到特異性熒光。將 N蛋白多克隆抗體進(jìn)行倍比稀釋后與感染RC-HL48h的BHK細(xì)胞中N蛋白進(jìn)行反應(yīng),