狂犬病病毒N和G蛋白多克隆抗體的制備.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起的人畜共患病急性傳染病。人被RV感染后,一旦出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,幾乎百分之百死亡,我國每年超過1000人死于狂犬病?？梢?狂犬病嚴重威脅人類的健康。隨著分子生物學、基因組學和蛋白組學的廣泛應用,對RV各蛋白的功能、致病機制、出芽過程的研究取得巨大進展,但依舊沒有完全透徹。透徹研究這些機制,將有助于治療狂犬病藥物的開發(fā)和免疫疫苗質(zhì)量的提高。目前,由于缺乏適用的RV單克隆或多克隆抗體,嚴重

2、阻礙了我們研究的步伐,適用抗體的研制已成為相關研究的前提條件。核蛋白(N)蛋白對病毒的轉錄復制至關重要,制備N蛋白抗體用于檢測 N蛋白表達量,繼而評價病毒的轉錄復制能力。糖蛋白(G)是RV的主要保護性抗原,同時它還與病毒的嗜神經(jīng)性、致病性密切相關,所以制備適用的G蛋白抗體十分必要。
　　N蛋白的主要線性抗原結構區(qū)域位于360-383位氨基酸殘基。本文以 RC-HL N基因質(zhì)粒為模板,利用兩對引物 RV-NF1/R1、RV-NF2/

3、R2分別擴增N1-2(350-410位氨基酸)、N3-4(360-451位氨基酸)兩個片段。再利用RV-NF1和RV-NR2兩條末端互補的引物和N1-2、N3-4片段膠回收產(chǎn)物進行重疊PCR,擴增出N1-4片段。并將其克隆至 pMD18-T載體得到 pMD-N1-4質(zhì)粒,雙酶切后亞克隆到 pET-32a原核表達載體。轉化宿主菌Rosetta并利用IPTG誘導蛋白表達,SDS-PAGE分析重組N蛋白,發(fā)現(xiàn)主要以包涵體形式表達。重組N蛋白經(jīng)

4、Ni-NTA親和層析配合含不同濃度尿素的包涵體洗滌液進行純化。對純化后的蛋白進行梯度透析,使其復性重折疊。復性蛋白配合弗氏佐劑按照合理的免疫程序進行小鼠免疫,采集血清制備多克隆抗體。Western blot檢測感染RC-HL48h的BHK細胞中N蛋白的表達,出現(xiàn)50.5 kd的目的條帶;間接免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)抗體能和N蛋白發(fā)生良好反應,檢測到特異性熒光。將 N蛋白多克隆抗體進行倍比稀釋后與感染RC-HL48h的BHK細胞中N蛋白進行反應,