狂犬病病毒G+N雙基因重組腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的致死性人畜共患傳染病.用狂犬病疫苗進(jìn)行預(yù)防注射是預(yù)防和控制狂犬病發(fā)生的有效途徑.現(xiàn)用疫苗具有較好的免疫效果,但受生產(chǎn)成本昂貴及給藥方式等因素的限制,不便應(yīng)用于各種野生和家養(yǎng)動物的免疫接種.重組腺病毒載體具有宿主范圍廣、對外界環(huán)境有一定的抵抗能力以及可口服誘導(dǎo)免疫等優(yōu)點,可作為基因工程狂犬病疫苗的優(yōu)良載體.研究和開發(fā)重組復(fù)制缺陷型腺病毒的狂犬病疫苗將有望預(yù)防控制甚至根除我國狂犬病的發(fā)生.狂犬病病毒共有5種結(jié)構(gòu)

2、蛋白,其中糖蛋白(glycoprotein,GP)與病毒的感染和免疫有密切關(guān)系,一直是重組疫苗的研究熱點;核蛋白(Nucleoprotein,NP)是除GP以外具有免疫原性的另一種重要結(jié)構(gòu)蛋白,近年來倍受研究者的關(guān)注.試驗選用狂犬病病毒CVS毒株經(jīng)腦腔攻擊后發(fā)病小鼠的腦組織,提取總RNA,用帶接頭的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),分別擴(kuò)增出狂犬病病毒NP基因和GP基因,將NP基因和GP基因克隆入質(zhì)粒載體pMD18-T,

3、對篩選所獲得的含有NP和GP基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行全基因序列測定,然后用DNAStar軟件進(jìn)行序列對比分析,結(jié)果表明成功地克隆出具有強(qiáng)神經(jīng)毒力的狂犬病病毒CVS毒株的NP基因和GP基因.本研究將狂犬病病毒GP基因和NP基因串聯(lián),利用復(fù)制缺陷型腺病毒載體首次成功構(gòu)建了同時攜有GP和NP的重組腺病毒.在構(gòu)建重組腺病毒的試驗中,首先將GP基因和NP基因分別從其各自的克隆載體上雙酶切消化,然后再將GP和NP基因同時亞克隆入腺病毒穿梭載體pAdTra

4、ck-CMV,經(jīng)卡那霉素抗性和酶切篩選獲得了含有Gr+N的重組穿梭質(zhì)粒-pAdTrack-CMV/G+N.然后采用在生長周期短、便于操作的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效同源重組的方法,即將此重組穿梭質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體質(zhì)粒的大腸桿菌BJ5183,通過同源重組獲得了插有外源基因的重組腺病毒質(zhì)粒.最后,經(jīng)Pac I酶切以釋放病毒反轉(zhuǎn)錄末端重復(fù)序列為自由末端,以此重組感染性腺病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,成功地得到含有狂犬病病毒G+N雙基因的