狂犬病病毒屬7種主要病毒檢測芯片的研制.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒屬(Lyssavirus,Lv)引起的所有溫血動物都易感的烈性傳染病。目前該屬有14種病毒,包括國際病毒分類委員會(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)公布的12種Lv,分別為7種主要Lv和5種新定Lv,以及最新發(fā)現(xiàn)的2種待定的Lv。除第2種,及5種新定Lv和2種新發(fā)現(xiàn)的病毒未見報道外,其他Lv成員都能引起人的狂犬病。本實驗所涉及Lv的7種主要病毒分別為:第1

2、種Lv,經(jīng)典狂犬病病毒(Classicrabiesvirus,RABV);第2種Lv,拉各斯蝙蝠病毒(Lagosbatvirus,LBV);第3種Lv,蒙哥拉病毒(Mokolavirus,MOKV);第4種Lv,杜文哈根病毒(Duvenhagevirus,DUVV);第5種Lv,歐洲蝙蝠狂犬病病毒1型(Europeanbatlyssavirus1,EBLV-1);第6種Lv,歐洲蝙蝠狂犬病病毒2型(Europeanbatlyssavir

3、us2,EBLV-2);第7種Lv,澳大利亞蝙蝠病毒(Australianbatlyssavirus,ABLV)。目前99.8％的人和動物的狂犬病是由這7種主要Lv引起。
　　OIE推薦的狂犬病確診金標(biāo)方法―動物腦組織直接免疫熒光(FAT)不能對Lv鑒別。目前對Lv鑒別檢測的分子檢測技術(shù),如RT-PCR、RT-qPCR、PCR結(jié)合測序等方法,存在著檢測通量低、靈敏度不高、特異性不強(qiáng)和費(fèi)時費(fèi)力的缺點。因此,建立一種對7種主要Lv快速

4、檢測和鑒別的方法尤為必要?；蛐酒夹g(shù)為病毒性傳染病診斷提供了高效、特異和自動化的方法,其原理為將已知核酸序列按照一定矩陣點制到固相載體上,這些探針再和具有熒光標(biāo)記的核酸靶標(biāo)雜交,雜交結(jié)果通過具有相應(yīng)熒光激發(fā)波長的掃描儀獲取。
　　本研究目的：建立一種對7種主要Lv快速、靈敏檢測和鑒別的基因芯片方法,并用狂犬病疑似臨床樣品對建立的方法評估。
　　方法：根據(jù)目前7種主要Lv的N基因編碼區(qū)62-442nt片段設(shè)計Lv特異寡核苷酸

5、探針,每個種設(shè)計多條探針使之在最大程度上覆蓋該種所有變異株。寡核苷酸探針長度為60-70nt,允許一定數(shù)量的堿基錯配,可用于檢測同源性高的新變異株。使用可擴(kuò)增Lv所有種的巢式RT-PCR(RT-nPCR),擴(kuò)增標(biāo)記N基因的62-442nt片段,以提高芯片的檢測靈敏度。比較評估基因芯片方法和目前常規(guī)狂犬病診斷方法在狂犬病臨床樣品檢測中的靈敏性和特異性。
　　本課題的主要結(jié)果：
　　1、探針設(shè)計及篩選
　　本研究選取206

6、條Lv各種具有代表性毒株N基因序列作為芯片探針設(shè)計的參考序列,與Lv同源性極低的E.colipGM-T質(zhì)粒和擬南芥的一段基因組作為對照探針設(shè)計參考序列,共設(shè)計了長度為60-70nt,Tm值為75±5℃的寡核苷酸探針78條,對照探針7條。通過BLAST及標(biāo)準(zhǔn)參考毒株篩選驗證,最終確定50條種特異探針和7條對照探針用以構(gòu)建Lv芯片,命名為:“LyssaChip”。
　　2、LyssaChip設(shè)計
　　在對LyssaChip探針點

7、樣矩陣設(shè)計時,為方便芯片雜交結(jié)果觀察,我們設(shè)計了“表盤式”探針點樣模式。該模式為:中心與四角4個探針點為綠色熒光標(biāo)記探針,用于定位“表盤”位置,共8個點;點樣圖12點鐘方向為陽性對照探針6個點、陰性對照探針6個點;1點到2點鐘方向為Lv第1種(RABV)探針點陣,共12個;3點鐘方向為Lv第2種(LBV)探針點陣,共14個;4點到5點鐘方向為Lv第3種(MOKV)的探針點陣,共17個;6點鐘方向為Lv第4種(DUVV)探針點陣,共12個

8、;7點到8點鐘方向為Lv第5種(EBLV-1)探針點陣,共12個;9點鐘方向為Lv第6種(EBLV-2)探針點陣,共22個;10點到11點鐘方向為Lv第7種(ABLV)探針點陣,共14個。每個探針點均為2個重復(fù),每種均有6到11條探針,以期在最大程度上檢測各種Lv的所有亞型。
　　為提高LyssaChip檢測通量,我們在一張芯片點制12個“表盤式”探針點陣,同時用于12份樣品檢測,可以完成中通量的檢測任務(wù)。
　　3、Lyss

9、aChip構(gòu)建及優(yōu)化
　　所有寡核苷酸探針經(jīng)氨基化修飾,用芯片點樣儀印跡于醛基化修飾的玻璃基片上,制備芯片。通過優(yōu)化標(biāo)記樣品制備、雜交液配置和雜交條件,確定了LyssaChip標(biāo)準(zhǔn)使用流程:常規(guī)方法提取樣品RNA,用HEX修飾過的引物擴(kuò)增標(biāo)記靶核酸;用12μL雜交緩沖液(99%甲酰胺、1×SSC、2%SDS、50×Denhardt’s、標(biāo)記陽性對照各2μL,補(bǔ)水至12μL)混合8μl熒光標(biāo)記樣品,43℃雜交3.5h;用芯片掃描儀讀

10、取雜交結(jié)果,陽性點定義:SNR≥2,且F532Median-B532≥800,反之為陰性點。
　　4、LyssaChip驗證及評估
　　用Lv的1-7種參考滅活病毒驗證,LyssaChip方法可準(zhǔn)確而特異地鑒別區(qū)分這7種參考毒株。
　　LyssaChip可檢測最低cDNA模板濃度:RABV,LBV,MOKV,DUVV,EBVV-1,和ABLV為2.46×105molecules/μl;EBLV-2為2.46×104mo

11、lecules/μl;可檢測最低狂犬病標(biāo)準(zhǔn)SRV9疫苗細(xì)胞毒滴度為0.158個TCID50/ml,其靈敏度是本實驗已建立RT-nPCR和RT-qPCR方法的10倍。
　　對RABV,DUVV,EBLV-2,ABLV滅活病毒模擬臨床多重感染試驗表明,LyssaChip具有同時檢測樣品中不同種病毒交叉感染的能力。對LyssaChip保存期(第30、60、90、150和210天)和保存環(huán)境(-20℃、4℃和常溫20±2℃)試驗評估,確定

12、LyssaChip最佳保存條件和時間為-20℃避光保存,有效期至少為150天。
　　5、LyssaChip應(yīng)用
　　本研究用LyssaChip檢測臨床樣品共111份,其中65份為2004-2010年間本實驗室保存的狂犬病臨床疑似動物腦組織樣品(犬、牛、羊、貉),46份犬腦組織樣品為2010年湖南動物疾控中心送檢的采集于寧遠(yuǎn)縣和衡陽市部分狗肉館的樣本。這111份臨床疑似樣品分別使用金標(biāo)方法FAT、常規(guī)RT-nPCR和Lyssa

13、Chip鑒定。相對于金標(biāo)方法FAT,LyssaChip表現(xiàn)出很高的靈敏性(CI:94.48%-100%)和特異性(CI:82.10%-98.63%)。經(jīng)過Kappa一致性檢驗,LyssaChip與金標(biāo)方法FAT具有非常高的一致性(κ=0.944);McNemarχ2差異性檢驗結(jié)果表明,這兩種方法之間不一致部分(3份FAT陰性,LyssaChip陽性)的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),說明LyssaChip陽性檢出率更高。另外,L

14、yssaChip結(jié)果與本實驗室建立的RT-nPCR方法同樣表現(xiàn)出非常高的一致性(κ=0.981)。
　　在2010年歐盟舉行的國際狂犬病實驗室間比對試驗中,我們使用LyssaChip方法準(zhǔn)確檢測出送檢的7份盲樣中陽性和陰性樣品,并成功鑒別出陽性樣品中4種Lv,分別為RABV,EBLV-1,EBLV-2,ABLV。該方法與同時應(yīng)用于盲樣檢測的FAT、RT-nPCR和RT-qPCR方法的共同陽性檢出樣品完全符合;所不同的是相對于RT-

15、qPCR,LyssaChip多檢出4種Lv感染的樣品;相對于FAT和RT-nPCR,LyssaChip區(qū)分出了樣品中病毒的種類。
　　本課題研制的LyssaChip可應(yīng)用于快速、高通量檢測和區(qū)分臨床樣品中7種Lv主要病毒。一張LyssaChip可同時檢測12份樣品,所需操作時間不到8小時,其中包括:1小時RNA提取,3小時RT-nPCR,3.5小時芯片雜交和30分鐘芯片洗滌和掃描。而同樣工作,傳統(tǒng)基于RT-nPCR產(chǎn)物測序方法是不