利用siRNA抑制狂犬病病毒復(fù)制的研究.pdf

1、狂犬病是一種死亡率幾乎達(dá)到100％的人畜共患急性傳染病，至今尚無(wú)有效的治療方法，唯一的措施就是在病毒暴露前后進(jìn)行免疫預(yù)防。但由于存在疫苗質(zhì)量、保護(hù)期、接種時(shí)機(jī)等問(wèn)題，致使該病屢有發(fā)生，給人們帶來(lái)生命的威脅。本文擬利用RNA干擾技術(shù)，抑制狂犬病病毒在細(xì)胞和機(jī)體中的復(fù)制，為今后進(jìn)行狂犬病的抗病育種研究工作奠定基礎(chǔ)。 首先根據(jù)狂犬病病毒的全長(zhǎng)基因信息，利用計(jì)算機(jī)軟件，選擇了分別針對(duì)狂犬病病毒的N(核蛋白基因)、P(磷蛋白基因)和L(R

2、NA聚合酶基因)基因的4個(gè)siRNA靶序列，隨后合成了相應(yīng)的8條寡核苷酸單鏈，將兩兩互補(bǔ)的寡核苷酸單鏈經(jīng)退火形成siRNA基因，克隆到pStrike-U6載體上，構(gòu)建了表達(dá)siRNA的4種質(zhì)粒，分別為pU6-siSTRIKET<'TM>N(1)、pU6-siSTRIKE<'TM>P(2)、pU6-siSTRIKE<'TM>L<,1>(3)、pU6-siSTRIKE<'TM>L<,2>(4)，經(jīng)PCR檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果證明，序列正確。

3、 在細(xì)胞水平上，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將構(gòu)建的4個(gè)表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用濃度為1000μg/ml的G-418進(jìn)行篩選。PCR和IRT-PCR實(shí)驗(yàn)都證明，表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)BHK-21細(xì)胞，成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)siRNA的單克隆細(xì)胞株。用TCID<,50>=10<'-6.25>/25μl的病毒經(jīng)10倍倍比稀釋后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接毒，細(xì)胞病變結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞與1～4號(hào)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)CPE的病毒最大稀釋度分別為10<'

4、-6>、10<'-3>、10<'-4>、10<'-4>、10<'-3>，可見(jiàn)4種篩選的穩(wěn)定細(xì)胞株較對(duì)照細(xì)胞，接毒后病毒毒力明顯降低；病毒空斑形成試驗(yàn)證明，加入稀釋度為10<'-5>的病毒液后，對(duì)照細(xì)胞的PFU為10<'-7.23>/0.2ml，1～4號(hào)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PFU分別為10<'-6.65>/0.2ml、10<'6.95>/0.2ml、10<'-7.15>/0.2ml、10<'-6.40>/0.2ml，可見(jiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株上病毒滴

5、度都有所降低，1號(hào)和4號(hào)細(xì)胞上病毒滴度降低尤為明顯：最后，用篩選的穩(wěn)定細(xì)胞株分別培養(yǎng)病毒，收獲病毒液，進(jìn)行乳鼠腦內(nèi)接毒，1～4號(hào)病毒與正常細(xì)胞病毒對(duì)乳鼠的LD<,50>分別為：10<'-3.17>/0.02ml、10<'-4.38>/0.02ml、10<'-3.63>/0.02ml、10<'-3.11>/0.02ml和10<'-5.68>/0.02ml。由此可知，1～4號(hào)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株培養(yǎng)的病毒較正常細(xì)胞培養(yǎng)的病毒對(duì)乳鼠的LD<,50>

6、明顯降低，1號(hào)和4號(hào)的病毒液LD<,50>降低更明顯，與病毒空斑形成試驗(yàn)結(jié)果相一致。因此，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi對(duì)狂犬病病毒的復(fù)制有明顯的抑制效應(yīng)。 在小鼠個(gè)體水平上，通過(guò)卵巢注射法，將質(zhì)粒注射到性成熟的母鼠卵巢中，然后將其與性成熟的公鼠合籠，懷孕后產(chǎn)下仔鼠，共獲得仔鼠85只。PCR檢測(cè)仔代小鼠的基因組，共獲得陽(yáng)性小鼠32R，陽(yáng)性率N36.4％。結(jié)果表明，siRNA基因已經(jīng)成功整合入染色體中。但測(cè)序結(jié)果表明，整合的siRNA