狂犬病病毒快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、狂犬病是一種重要的人獸共患傳染病，近年來狂犬病在我國的發(fā)生呈逐年上升的趨勢，究其原因，除了免疫措施不到位、免疫效果低下之外，無法及時(shí)對狂犬疫苗免疫后血清中和抗體效價(jià)進(jìn)行檢測，因此不能實(shí)現(xiàn)人群及動物種群的免疫檢測也是主要原因之一。按照世界衛(wèi)生組織(WHO)及國際獸疫局(OIE)的要求，人或動物接種狂犬病疫苗后，需測定其血清內(nèi)的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)中和抗體效價(jià)，不低于0.5IU/ml[1]時(shí)，方可認(rèn)為達(dá)到有效保護(hù)，否

2、則應(yīng)予加強(qiáng)免疫，直至達(dá)到保護(hù)水平。
　　 當(dāng)前，檢測狂犬病病毒中和抗體國際通用方法主要包括小鼠中和試驗(yàn)（MNT）、熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)和快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT）。其中MNT法操作比較復(fù)雜，需要在動物P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行且實(shí)驗(yàn)周期長，難以推廣應(yīng)用和達(dá)到快速檢測;FAVN是以100TCID50的狂犬病病毒完全被血清抑制作為判定標(biāo)準(zhǔn)，是國際狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室最主要的動物狂犬病中和抗體監(jiān)測方法，主要用于犬血清的檢測;快速熒光

3、灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)是用80％最適感染量的病毒與抗狂犬病血清相中和，計(jì)算出中和50％病毒量的最高血清稀釋度，并與已知效價(jià)的血清標(biāo)準(zhǔn)品對照計(jì)算出血清中和抗體效價(jià)，RFFIT方法操作簡便快捷，重復(fù)性好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程比MNT和FAVN耗時(shí)短，是WHO和OIE的現(xiàn)行推薦方法之一，也是我國藥典規(guī)范應(yīng)用的狂犬病病毒中和抗體檢測方法，既可用于人的狂犬病病毒中和抗體測定，也可用于動物的狂犬病病毒中和抗體測定。目前，我國只有武漢生物制品研究所和中國藥

4、品生物制品檢定所具有本項(xiàng)技術(shù)，本研究于中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腦炎室進(jìn)行，以便在疾病預(yù)防控制系統(tǒng)建立此方法并進(jìn)行初步應(yīng)用。
　　 本研究結(jié)果建立了狂犬病病毒中和抗體快速熒光灶抑制試驗(yàn)（RFFIT），初步應(yīng)用成功。
　　 本研究首先培養(yǎng)BSR細(xì)胞，低代次傳代培養(yǎng)后進(jìn)行了凍存，共凍存了40管，建立了BSR細(xì)胞庫。用直接免疫熒光試驗(yàn)方法(DFA)測定狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)攻擊種病毒CVS-11株的滴度為1.7×107FFU/

5、ml，按照MOI=0.1的比例接種BSR細(xì)胞，制備CVS-11貯存用病毒庫共500ml，并分裝于凍存管凍存于-80℃冰箱內(nèi)儲存。同樣用DFA的方法測定貯存用病毒的滴度為2×107FFU/ml;測定貯存病毒的最適攻擊量為6×106FFU/ml，應(yīng)用于RFFIT試驗(yàn)中;設(shè)定病毒對照、細(xì)胞對照、標(biāo)準(zhǔn)血清對照、陰性血清對照、強(qiáng)陽性血清對照和弱陽性血清對照六項(xiàng)對照系統(tǒng)，以Reed&Muench法公式和MicrosoftExcel軟件為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)被

6、測樣品中和效價(jià)計(jì)算公式。應(yīng)用建立好的RFFIT系統(tǒng)進(jìn)行大批量的血清檢測，評價(jià)該檢測系統(tǒng)的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)室建立的RFFIT檢測系統(tǒng)可以應(yīng)用于狂犬病特異性中和抗體的檢測。
　　 國產(chǎn)成大疫苗分別按照五針法和2-1-1四針法肌肉注射免疫程序?qū)?12位志愿者進(jìn)行暴露前免疫接種，然后分別在接種第0、7、14、45天時(shí)進(jìn)行采血，共采集血清標(biāo)本471份。用RFFIT方法對采集的471份血清進(jìn)行狂犬病中和抗體的

7、檢測，結(jié)果:國產(chǎn)成大疫苗五針法免疫和2-1-1四針法免疫所得到的免疫效果差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有意義，其中2-1-1四針法免疫后第七天的中和抗體GMT比五針法稍高，且陽轉(zhuǎn)率也要稍高于五針法;國產(chǎn)成大疫苗2-1-1四針法和進(jìn)口雞胚疫苗2-1-1四針法的免疫效果差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有意義，其中第七天的陽轉(zhuǎn)率也要高于進(jìn)口雞胚疫苗。
　　 近年來中國人用狂犬病疫苗的生產(chǎn)量不斷增加，每年因狂犬病暴露而接受暴露后治療人數(shù)接近1000萬，但暴露后治療的