抗狂犬病病毒單克隆抗體的制備及初步研究.pdf

1、狂犬病是一種重要的世界性人獸共患傳染病，據(jù)衛(wèi)生組織報告，全球每年報告5.5萬例人狂犬病，該病病程進(jìn)展迅速，一旦發(fā)病，100％死亡，而且全世界該病治愈病例極少，因此對該病的準(zhǔn)確快速、特異性的診斷方法和有效的疫苗的研究顯得尤為重要。
　　 1978年Wiktor報道狂犬病病毒單克隆抗體的制備，此后，狂犬病病毒單克隆抗體在狂犬病的診斷和免疫學(xué)分析中得到了廣泛的應(yīng)用，并有望在狂犬病暴露后預(yù)防中替代免疫球蛋白發(fā)揮作用。WHO推薦的用于狂犬

2、病病原學(xué)實驗室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光(DFA)以及評價狂犬病病毒(RV)中和抗體的快速免疫熒光灶抑制試驗(RFFIT)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外。這兩種檢測方法均需要抗RV核蛋白(NP)熒光標(biāo)記抗體，而RV在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量較低，不易從RV顆粒獲得大量純化的NP，目前這種檢測試劑在國內(nèi)尚沒有獲得批準(zhǔn)文號和商業(yè)途徑可以獲得，而進(jìn)口產(chǎn)品價格昂貴，因此限制了這兩種檢測方法在國內(nèi)的普遍應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)化。鑒于這種情況，此類研究的開展，將非常有助于發(fā)展我國具有

3、自主知識產(chǎn)權(quán)的狂犬病實驗室檢測和診斷用試劑，提高我國狂犬病監(jiān)測能力。
　　 本實驗分為三部分內(nèi)容，包括狂犬病病毒單克隆抗體的制備鑒定，單克隆抗體的標(biāo)記以及標(biāo)記單抗的初步應(yīng)用。
　　 本實驗室采用人用狂犬病疫苗PV株、桿狀病毒表達(dá)的RV核蛋白以及狂犬病病毒野毒株HN10，作抗原免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行融合;利用間接免疫熒光法篩選雜交瘤細(xì)胞后，經(jīng)克隆后建株，獲得特異穩(wěn)

4、定分泌抗狂犬病病毒單克隆抗體細(xì)胞株，并將此細(xì)胞株經(jīng)小鼠腹腔注射制備單抗腹水;然后進(jìn)行了抗體亞類、特異性和敏感性以及蛋白免疫印記等的系統(tǒng)鑒定，利用SPA親和層析的方法進(jìn)行腹水純化，通過常規(guī)方法對所得單抗進(jìn)行辣根過氧化物酶（HRP）和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記，確定FITC標(biāo)記抗體的工作濃度后對實驗室現(xiàn)存的部分標(biāo)本進(jìn)行了檢測，設(shè)置Millipore公司的標(biāo)記單抗為陽性對照，對兩者的檢測結(jié)果進(jìn)行了分析比較。
　　 每次融合，融合率

5、達(dá)到80％以上，融合后，立即將融合細(xì)胞液稀釋到15-20塊融合板，經(jīng)過陸續(xù)三批的檢測，1-2次的亞克隆，最終獲得3株（3B12、4A12和5B8）特異穩(wěn)定分泌抗狂犬病病毒單抗細(xì)胞株，前兩者腹水效價分別為1∶8000，1∶10000。
　　 由于5B8獲得比較晚，后續(xù)工作針對前兩株單抗進(jìn)行，經(jīng)鑒定，單抗亞類型為抗狂犬病病毒IgG2a亞類;經(jīng)Western-blot鑒定兩株單抗細(xì)胞株能高效價穩(wěn)定特異分泌抗狂犬病病毒核蛋白單抗，且具有