抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：制備抗赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OA)的單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb)并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定,在此基礎(chǔ)上建立競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(competitive inhibition enzyme linked immunosorbent assay,ci-ELISA)用于OA的檢測(cè)。優(yōu)化小米和玉米中OA的提取方法,應(yīng)用建立的ci-ELISA檢測(cè)濟(jì)南市五個(gè)區(qū)的集市和超市出售的小米和玉米樣品中OA

2、的含量,初步了解污染情況。
　　 方法：采用小劑量長(zhǎng)周期的免疫方案,OA-牛血清白蛋白(bovine serumalbumin,BSA)偶聯(lián)物免疫雌性BALB/c小鼠,分別以O(shè)A-BSA、BSA為包被抗原,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)小鼠血清中抗體的效價(jià),觀察該McAb與BSA的交叉反應(yīng)情況。采用細(xì)胞融合的方法,以O(shè)A-BSA作為包被抗原,同時(shí)以BSA作

3、對(duì)照,用ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的McAb,獲得分泌抗OA的McAb的雜交瘤細(xì)胞株,研究該McAb與BSA的交叉反應(yīng)情況,以評(píng)價(jià)McAb的特異性。以有限稀釋法對(duì)特異性分泌抗OA McAb的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化,以ci-ELISA法進(jìn)一步確定McAb的特異性,腹水誘生法大量制備McAb,采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水中的McAb,以ELISA檢測(cè)純化前和純化后腹水效價(jià),同時(shí)以BSA作包被抗原對(duì)照,研究交叉反應(yīng)情況,以O(shè)A為競(jìng)爭(zhēng)

4、抗原,建立ci-ELISA方法用于OA的檢測(cè)。選用不同濃度甲醇和氯化鈉的溶液作提取溶劑提取樣品中的OA,比較不同提取溶劑的加標(biāo)回收率,觀察提取溶劑中甲醇和氯化鈉的濃度對(duì)小米、玉米樣品中OA提取效果的影響,優(yōu)化OA提取方法。采集濟(jì)南市市中、歷下、槐蔭、天橋、歷城五個(gè)區(qū)的集市出售的小米和玉米、濟(jì)南市區(qū)超市出售的小米和玉米各50份,用所建立的ci-ELISA,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,對(duì)這些小米、玉米樣品中OA含量進(jìn)行了檢測(cè),計(jì)算檢出率,并依照《中國(guó)國(guó)

5、家標(biāo)準(zhǔn)GB2715--2005(糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))》中對(duì)谷類、豆類的OA的限量要求,計(jì)算超標(biāo)率。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS軟件包處理。
　　 結(jié)果：OA-BSA免疫的BALB/c小鼠血清抗體效價(jià)為1:512000,與BSA有強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)。細(xì)胞融合后,ELISA篩選抗體分泌陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株,抗OA-BSA的McAb與BSA的交叉反應(yīng)率僅為3.50％,對(duì)分泌抗OA-BAS特異的McAb的細(xì)胞株經(jīng)3輪克隆化,抗體分泌陽(yáng)性率達(dá)到100％,建立

6、了1株能穩(wěn)定分泌抗OA-BSAMcAb的雜交瘤細(xì)胞株,ci-ELISA進(jìn)一步證明了該抗體是特異針對(duì)OA的。腹水誘生法制備了大量的McAb,純化后腹水抗體效價(jià)為1:512000,而且與BSA無(wú)交叉反應(yīng)。Ci-ELISA線性范圍為0.04ng/ml-1250.00ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程y=-0.1368x+0.6796,相關(guān)系數(shù)r=0.9965,檢測(cè)下限為0.04ng/ml。當(dāng)提取溶劑中甲醇含量為60％且含有5％氯化鈉時(shí)對(duì)OA的提取

7、效果較為理想,OA加標(biāo)量為50.00ng/g、25.00ng/g、12.50ng/g時(shí),以該提取溶劑進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn),小米各加標(biāo)量的平均回收率(％)分別為93.52％、96.86％、95.66％;變異系數(shù)(CV％)分別為4.59％、8.42％、8.94％,平均7.32％;玉米各加標(biāo)量的平均回收率分別為96.30％、98.67％、98.13％,變異系數(shù)(CV％)分別為5.74％、5.59％、9.56％,平均6.96％。用于檢測(cè)小米中OA的ci

8、-ELISA工作曲線線性方程為y=-0.3249x+1.079,相關(guān)系數(shù)r=0.9959,用于檢測(cè)玉米中OA的ci-ELISA工作曲線線性方程為y=-0.2554x+0.9561,相關(guān)系數(shù)r=0.9971。小米、玉米OA檢測(cè)下限均為0.04ng/ml,OA最低限出量均為0.2ng/g。采集的所有樣品中,小米OA檢出率為41％(41/100),玉米OA的檢出率為38％(38/100),二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05),其中,集市小米OA的

9、檢出率為26％(13/50),集市玉米OA檢出率為32％(16/50),二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05);超市小米OA檢出率為56％(28/50),超市玉米OA檢出率為44％(22/50),二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05);檢測(cè)的所有小米樣品中,超市小米OA檢出率(56％)明顯高于集市小米(26％)(P＜0.05);檢測(cè)的所有玉米樣品中,超市玉米(44％)和集市玉米(32％)Oh檢出率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。采集的所有樣品中,小米

10、(0.40-4.45ug/kg,中位數(shù)為1.73ug/kg)和玉米(0.48-4.02ug/kg,中位數(shù)為1.61ug/kg)OA含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。其中,集市小米(0.41-3.94ug/kg,中位數(shù)為1.63ug/kg)和集市玉米(0.53-3.99ug/kg,中位數(shù)為1.52ug/kg)、超市小米(0.40-4.45ug/kg,中位數(shù)為1.78ug/kg)和超市玉米(0.48-4.02ug/kg,中位數(shù)為1.74ug

11、/kg)OA含量均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。檢測(cè)的所有小米樣品中,超市小米(中位數(shù)為1.78ug/kg)與集市小米(中位數(shù)為1.63ug/kg)OA含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05),檢測(cè)的所有玉米樣品中超市玉米(中位數(shù)為1.74ug/kg)和集市玉米(中位數(shù)為1.52ug/kg)OA含量均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。本研究檢測(cè)的所有樣品的OA含量在0.40-4.45ug/kg之間,中位數(shù)為1.67ug/kg,根據(jù)《中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB

12、2715-2005(糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))》中對(duì)谷類、豆類的OA的限量≤5ug/kg的要求,所有樣品中的OA含量均未超標(biāo)。
　　 結(jié)論：獲得了分泌抗OA的McAb的雜交瘤細(xì)胞株。半抗原單抗的制備過(guò)程中,免疫抗原和檢測(cè)抗原可以用同一種載體,從而使完全抗原的制備大大簡(jiǎn)化。在此抗OA-McAb基礎(chǔ)上,建立了ci-ELISA方法,用于OA檢測(cè)。該檢測(cè)方法靈敏度較高,滿足了《中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2715-2005(糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))》中對(duì)谷類、豆類的OA