黃曲霉毒素B1和金黃色葡萄球菌C型腸毒素單克隆抗體制備及應(yīng)用.pdf

1、生物毒素(biological toxins)是生物體分泌的有毒代謝化學(xué)物，包括動(dòng)物、植物、海洋生物和微生物等產(chǎn)生的對(duì)其它生物物種有毒害作用的各種化學(xué)物質(zhì)。微生物污染食品，在適宜的條件下產(chǎn)生毒素，這些毒素伴隨著食物被人們食用后引起的一系列急慢性中毒稱為微生物毒素性食物中毒。微生物食物中毒常見多發(fā)，以真菌和細(xì)菌毒素污染最普遍。
　　黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)是自然界中已發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的真菌毒素，主要是由黃曲霉(Asp

2、ergillus flavus)、特曲霉(Aspergillus nomius)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，其中常見的黃曲霉毒素分別是B1、B2、G1、G2、M1、M2，毒性大小排列順序?yàn)锽1＞B2＞G1＞M1＞G2＞ M2[7-8]。黃曲霉毒素B1的毒性最大，致癌力最強(qiáng)。黃曲霉毒素的檢測(cè)方法包括薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金檢測(cè)技

3、術(shù)等，其中酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法具有特異、靈敏、簡單、經(jīng)濟(jì)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。
　　金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是由金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的外毒素，常引發(fā)食物中毒。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的SEs大約有20種，其中SEA和SEB研究較多，對(duì)于有三個(gè)亞型的SEC研究較少。金葡菌腸毒素的檢測(cè)方法主要有動(dòng)物試驗(yàn)鑒定法、免疫學(xué)方法和針對(duì)毒素編碼基因的分子生物學(xué)

4、方法。其中，腸毒素檢測(cè)多采用免疫學(xué)檢測(cè)方法。
　　本研究旨在(1)制備高親和力和特異性的AFB1單克隆抗體，建立AFB1間接競爭ELISA檢測(cè)方法，并試用于實(shí)際樣品檢測(cè);(2)制備高親和力和特異性的SEC單克隆抗體和多克隆抗體，并建立SEC的ELISA檢測(cè)方法。
　　1.利用碳二亞胺法制備黃曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA，經(jīng)紫外分析和ELISA鑒定偶聯(lián)成功，蛋白濃度為2.5mg/mL，測(cè)定其偶聯(lián)比為8.4∶1～9.3∶

5、1，獲得了具有較好偶聯(lián)比的完全抗原。
　　2.通過免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合、克隆化篩選等技術(shù)獲得了4株AFB1單克隆抗體，分別為1D6、2D9、3B9、1H4，測(cè)定效價(jià)均可達(dá)1∶204800。腹水純化效果良好，測(cè)定腹水得率最高的3B9的抗體亞類為IgG1，親和力常數(shù)為2.2×109L/mol。
　　3.利用3B9細(xì)胞株分泌的單抗建立了AFB1間接競爭ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)線性范圍為1.04～25ng/mL，檢測(cè)限為1.04ng/

6、mL，半數(shù)抑制率(IC50)為6.03ng/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10％，平均加標(biāo)回收率在線性范圍內(nèi)可達(dá)85％～120％，變異系數(shù)均小于10％。通過飼料樣品檢測(cè)證實(shí)，該方法與進(jìn)口ELISA試劑盒檢測(cè)一致性良好，可用于實(shí)際樣品中黃曲霉毒素B1的快速篩檢，并為黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　4.利用原核表達(dá)技術(shù)獲得了重組蛋白SEC，免疫Balb/c小鼠和新西蘭大白兔后獲得了SEC單克隆抗體和多克隆抗體。6株

7、SEC單克隆抗體分別為2B10、2C10、4G9、2E7、3B11、2C12，腹水效價(jià)可達(dá)1∶204800。多克隆抗體的效價(jià)可達(dá)1∶102400。測(cè)定6株單抗的相對(duì)親和力大小為2C12＞2C10＞3B11＞2E7＞4G9＞2B10，其中2C12的親和力常數(shù)為3.19×109L/mol，2B10的親和力常數(shù)為5.74×108L/mol。測(cè)定親和力最佳的2C12的抗體亞類為IgG2a。
　　5.分別利用SEC單克隆抗體和多克隆抗體建立