重組葡萄球菌腸毒素SEA和SEO單克隆抗體的研制.pdf

1、葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是由葡萄球菌產生的、已超過20種基因型報道的、氨基酸序列和結構相似,具有潛在超抗原活性的一組食源性致病毒素。目前對新發(fā)現(xiàn)腸毒素結構、功能活性的認識和不同型腸毒素的檢測鑒別尚缺乏有效手段。制備型特異性單抗對認識不同型腸毒素的結構和功能、不同毒素的檢測鑒別、分析腸毒素基因簇的表達調控機制等具有重要意義。本研究通過構建葡萄球菌腸毒素A(SEA)和O(SEO)的原核

2、表達載體,應用純化的重組葡萄球菌腸毒素制備了兩種腸毒素單克隆抗體,并對單抗特性做了研究。
　　 應用克隆的腸毒素基因sea、selo構建pET28α原核表達載體,轉化重組菌BL21(DE3)表達,經鎳鰲合層析純化獲得可溶性重組蛋白SEA-His、SEO-His。
　　 應用已構建的pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO表達載體轉化宿主菌BL21,經誘導表達、親和層析純化獲得SEA-GST、SEO-GST重組蛋白,

3、以此蛋白為免疫原免疫8周齡Balb／c小鼠,3次免疫后取其脾細胞與SP2／0骨髓瘤細胞融合,制備雜交瘤細胞。以SEA-His、SEO-His為包被蛋白建立間接ELISA方法篩選陽性克隆,陽性率分別為8.5％(34／400)、5.3％(24／450)。有限稀釋法對SEA腸毒素陽性雜交瘤細胞4A2,SEO腸毒素陽性雜交瘤細胞5C12、8C7進一步亞克隆,獲得穩(wěn)定分泌抗重組腸毒素蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為A型:4A2-C5、4A

4、2-B10；O型:5C12-C3、5C12-B4、8C7-G2、8C7-H8。
　　 對亞克隆獲得的雜交瘤細胞株分泌的單抗特性進行了研究。經間接ELISA檢測,4A2-C5、5C12-C3、8C7-G2雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價分別為1:1600、1:1600、1:6400,腹水效價分別達1:6.4×103、1:5.12×104、1:1.024×105；3株單克隆抗體4A2-C5、8C7-G2、5C12-C3親和常數分別為3.35×

5、106、1.89×106、1.45×106；亞類鑒定結果顯示,4A2-C5、5C12-C3為IgG2b亞類；8C7-G2為IgM亞類。競爭ELISA對單抗識別抗原位點的分析結果表明,5C12-C3和8C7-G2分別識別SEO蛋白的不同抗原表位；Western blotting表明獲得的3株單克隆抗體均能識別相應重組蛋白的B細胞線性表位；應用SEB和SEC1腸毒素陽性血清的阻斷ELISA結果表明,SEA、SEO、SEB和SEC1腸毒素間存