破傷風毒素C片段單克隆抗體的研制與鑒定.pdf

1、破傷風毒素是由破傷風梭菌在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生的強烈的神經(jīng)毒素，是已知最毒的毒素之一。根據(jù)破傷風毒素在體內的作用，將其分為A、B、C三個部分。破傷風毒素C片段(TetC)不具備神經(jīng)毒性，卻保留了完整毒素與神經(jīng)節(jié)苷脂結合等許多性質，免疫效果與毒素相當，是毒素的保護性抗原，用TetC蛋白誘導產(chǎn)生的單克隆抗體(McAb)具有中和毒素的能力。TetC與神經(jīng)元表面的結合是破傷風毒素其它片段發(fā)揮毒性作用的先決條件。本研究構建了原核表達TetC蛋白的重組大

2、腸桿菌，獲得具有抗原活性的融合蛋白，并制備了特異性針對TetC的McAbs，這為研究TetC的生物學功能、破傷風毒素結構與功能的關系提供重要條件，同時也為建立快速檢測破傷風抗毒素水平的方法提供了生物材料。 一、破傷風毒素C片段基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達根據(jù)破傷風梭菌64008菌株基因組DNA序列設計引物擴增TetC基因，并將其定向克隆至原核表達載體pGEX-6p-1，構建出重組菌BL21(pGEX-6p-1-TetC)，經(jīng)

3、IPTG(1mM終濃度)誘導表達，利用 Redipack GST purification module進行親和層析獲得純化的表達產(chǎn)物。SDS-PAGE結果表明表達的融合蛋白GST-TetC大小與預期一致。Western-blot檢測結果顯示融合蛋白GST-TetC可以與破傷風類毒素抗血清發(fā)生特異性結合反應，說明其具有良好的免疫原性。 二、破傷風毒素C片段單克隆抗體的制備及鑒定應用淋巴細胞雜交瘤技術，以重組菌Rosetta(DE

4、3)(pET-TetC)表達產(chǎn)物His-TetC蛋白免疫8w雌性BALB/c小鼠，100μg/只。首免時，抗原與等量弗氏完全佐劑(FCA)乳化，皮下分點注射。間隔2w，用弗氏不完全佐劑(FIA)乳化抗原，腹腔注射進行第二次免疫。此后每隔2w用弗氏不完全佐劑乳化抗原腹腔注射一次，直至ELISA檢測血清抗體效價達到1:10000以上，尾靜脈注射等量的不加佐劑的抗原作為加強免疫。3d后，取免疫小鼠脾細胞和骨髓瘤Sp2/0-Ag-14細胞進行融

5、合。以純化蛋白GST-TetC作為檢測抗原，用間接ELISA方法篩選陽性克隆，獲得5株穩(wěn)定分泌TetC單克隆抗體的細胞株，分別命名為1E5、5G10、689、7D6、7F5，亞類鑒定結果都為IgG<,1>，腹水測定效價除1E5為3×2<'10>外，其余均為1×10<'5>。Western-blot試驗顯示5株McAbs均能與融合蛋白His-TetC發(fā)生反應，出現(xiàn)特異性條帶，而與作為對照的空載體細菌Rosetta(DE3)(pET)和BL