產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O26LPS單克隆抗體的研制及單克隆抗體膠體金免疫層析方法的建立.pdf

1、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌0 2 6 L P S 單克隆抗體的研制及單克隆抗體膠體金免疫層析方法的建立D e v e l o p m e n t o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e sa g a i n s t L P S o fS h i g a t o x i n ··p r o d u c i n gE s c h e r i c h i a c o l i0 2 6 a

2、 n d o f g o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y b a s e d o n t h em o n o c l o n a la n t i b o d i e s研究生：徐婷婷專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)導(dǎo)師：高崧教授劉秀梵教授揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院2 0 1 1 年6 月?lián)P州大學(xué)碩士學(xué)位論文 2全菌發(fā)生反應(yīng)，效價(jià)分別為1 ：2 5 6 0 0 0 、1 ：1 0 2

3、4 0 0 、1 ：2 5 6 0 0 0 、1 ：1 2 8 0 0 0 、l ：1 2 8 0 0 0 。特異性分析表明，單抗4 G 1 1 除與牛場分離的S T E C 0 2 、S T E C 0 8 1 和羊場分離的S T E C0 3 9 、S T E C0 9 3 發(fā)生交叉反應(yīng)外，與其他血清型的S T E C 無交叉反應(yīng)，其他四株單克隆抗體則不與受試的其他血清型S T E C 發(fā)生交叉反應(yīng)，具有高度特異性和敏感性。單克隆抗

4、體1 C 1 0 、4 A 8 、4 G 1 l 的抗體亞類為I g G 2 a ，3 D 7 為l g G 2 b ，5 8 5 為I g M 。單抗親和層析法純化后，抗體非特異條帶消失，抗體含量在1 ．0m g ／r n L ～1 ．6m g ／m L 。以檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，用3 0 n m 膠體金標(biāo)記單克隆抗體4 A 8 制備金標(biāo)探針，分別以單克隆抗體1 C 1 0 和羊抗鼠I g G 作為硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)

5、控線，組裝膠體金試紙條，并對試紙條的檢測效果進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，抗體與膠體金結(jié)合的最佳p H 為8 ．5 ，用蛋白濃度梯度法確定膠體金與單抗最佳結(jié)合濃度為1 6I _ t g m L 。試紙條操作簡單，用肉眼1 5r a i n 內(nèi)可判定結(jié)果，對S T E C 0 2 6 具有高度特異性，與其他血清型S T E C 沒有交叉反應(yīng)。試紙條可檢出S T E C0 2 6 的最低濃度為1 x 1 0 7 C F U ／m L 。試紙條在室溫保

6、存1 個(gè)月，其特異性及靈敏度無明顯變化。用已建立的S T E C 0 2 6 免疫層析法對江蘇省某奶牛場的6 7 份糞樣進(jìn)行檢測，并與直接凝集試驗(yàn)結(jié)果比較，計(jì)算得出免疫層析法和直接凝集試驗(yàn)結(jié)果的陽性符合率為5 0 ％( 2 ／4 ) ，陰性符合率為9 6 ．9 ％( 6 3 ／6 5 ) ，總體符合率為9 7 ．O ％【( 2 + 6 3 ) ／6 7 ] 。上述結(jié)果表明，本研究建立的S T E C0 2 6 膠體金免疫層析檢測方法具有