普通免疫學單克隆抗體

1、普通免疫學(Immunology),抗體制備與抗原抗體反應及應用 抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）基因工程抗體的制備主要的抗原抗體反應免疫學在生物學中的應用,抗體的制備（多克隆與單克隆抗體） 抗原上那部分可以引起機體產生抗體的分子結構，叫做抗原決定簇。一個抗原上可以有許多不同的抗原決定簇，因而使機體產生許多不同的抗體。,抗體的制備（多克隆與單克隆抗體） 抗原上那部分可以

2、引起機體產生抗體的分子結構，叫做抗原決定簇。一個抗原上可以有許多不同的抗原決定簇，因而使機體產生許多不同的抗體。,,多克隆抗體具有異質性：如何表示？等電聚焦實驗能揭示多克隆抗體中的各種抗體具有不同的等電點。等電聚焦實驗： 蛋白質在pH梯度膠中電泳，每個分子沿著pH梯度遷移至電荷為中性的相應pH位置，并在此點積聚。,,多克隆抗體通常用兔制備的,The immune response to an antigen generally in

3、volves the activation of multiple B-cells all of which target a specific epitope on that antigen. As a result a large number of antibodies are produced with different specificities and epitope affinities these are known

4、as polyclonal antibodies.,用包含多種抗原決定簇的抗原物質免疫動物，從而刺激多個B細胞克隆產生針對多種抗原表位的不同抗體。因此，所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體(polyclonal antibody，pAb)，可以制作“生物導彈”。 另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，也稱為多克隆抗體。,,,抗血清的缺陷：

5、 每一種抗血清都不同于其他任何的抗血清，即使選用遺傳背景完全相同的動物，采用相同的抗原制劑和相同的免疫程序。 產生的抗血清只能是有限的數(shù)量，因此同一份血清制劑不可能長期使用或完成一系列復雜的實驗或臨床檢測。 即使是用親和層析技術純化的抗體也可能包含少量引起交叉反應的抗體，干擾對實驗的分析。,發(fā)展一種無限量能產生結構均一且已知特異性的抗體分子方法。,1975年Kǒhler和Milstein首先報道用

6、細胞雜交技術使經綿羊紅細胞（SRBC)免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合,建立起第一個B細胞雜交瘤細胞株,并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）。迄今世界已研制成數(shù)以千計的McAb。,"for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the di

7、scovery of the principle for production of monoclonal antibodies",,Jerne Kǒhler Milstein,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984,由一種克隆產生的針對一種細胞表位的特異性抗體叫做單克隆抗體。Monoclo

8、nal antibodies represent a single B lymphocyte generating antibodies to one specific epitope. 單克隆抗體為單一種B細胞克隆所產生的一種均一的免疫球蛋白，是一種獨特型的抗體。它的特異性是針對一個抗原決定簇的。,單克隆抗體的原理 骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，因此能在體外長期培養(yǎng)，但不能分泌特異性抗體；

9、 B淋巴細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖，因此不能長期培養(yǎng)。 免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限制增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。,在制備雜交瘤過程中的一個問題是什么？,如何解決？,讓未成雜交瘤的骨髓瘤細胞和脾臟細胞去死,HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進行選擇性培養(yǎng)。,5-磷酸核糖焦磷酸尿

10、嘧啶,RNADNA,次黃嘌呤（H） 胸腺嘧啶（T）,氨基蝶呤 （A）,合成主要途徑,合成替代途徑,,,,,,,TK,HPGRT,HPGRT：次黃嘌呤鳥嘌呤核苷轉移酶TK：胸腺嘧啶激酶,未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細胞合成核酸的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤合成核酸而死亡。,融合的雜交瘤細胞由于從脾臟細胞獲得了次

11、黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經過克隆選擇，可篩選出能產生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，在體內或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體。,未融合的親代脾臟細胞壽命有限，不久就死亡了。,三、單克隆抗體的制備過程 雜交瘤技術制備單克隆抗體的主要步驟包括：（1）抗原制備；（2）免疫動物；（3）免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備； （4）細胞融合； （5）雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)； （6）雜交瘤細

12、胞的篩選； （7）雜交瘤細胞的克隆化；（8）單克隆抗體的檢定； （9）分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立； （10）單克隆抗體的大量制備。,1、免疫動物 免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產生致敏B淋巴細胞的過程。 一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。 2、細胞融合 采用眼球

13、摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。,3、選擇性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成核酸而死亡。 未融合的脾細胞雖具有次黃嘌

14、呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤－鳥嘌呤－磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。,4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化 在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌所需特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產生

15、所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。,5、單克隆抗體的大量制備 單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內誘生法和體外培養(yǎng)法。 （1）體內誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見

16、小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。,（2）體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。近年來，各種新型培養(yǎng)技術和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產量。,鼠單抗也具有一些缺陷，主要是小鼠免疫系統(tǒng)不能識別某些免疫原。 另一方面，由于多克隆抗體識別的是抗原的多個抗原

17、決定簇，同時抗體的親和性要遠遠高于鼠來源的抗體，再加上技術環(huán)節(jié)的簡單性，所以一直具有不可取代的優(yōu)勢，也廣泛應用于科研及診斷。,如何得到高親和性、強特異性、廣譜識別性的抗體？,實驗動物的選擇： 做單抗的動物最開始是小鼠，后來又有像epitomics這樣的公司用兔子的(有特殊的專利)，還有一些人用大鼠神馬的，當然其它的動物的也有，據不完全統(tǒng)計，現(xiàn)在能用傳統(tǒng)方法制備單抗的動物已經有二三十種了。 但是最主流的還是小鼠和兔子了。,Monoclon

18、al antibodies (mAbs) from rabbits have not been available because no rabbit plasmacytomas (骨髓瘤樣腫瘤), from which a hybridoma fusion partner could be generated, have been identified.,1995年，Dr. Katherine Knight在Loyola Univer

19、sity of Chicago成功地在在轉基因兔中獲得骨髓瘤樣腫瘤(plasmacytoma)。其后幾年里，Dr. Robert Pytela 和 Mr. Weimin Zhu在UCSF將此技術進行了改進，使之能高產量的生產兔單克隆抗體。,兔單克隆抗體 (RabMAbs)： 新一代單克隆抗體用于科研、診斷和治療,,如何獲得骨髓瘤樣腫瘤?,在c-myc/v-abl轉基因兔身上成功地獲得了兔漿細胞瘤細胞系,proto-oncogenes (

20、原癌基因) 調控細胞生長和增殖的正常細胞基因。突變后轉化成為致癌的癌基因myc 轉錄因子 Burkitt 淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病 Abl-1: 非受體酪氨酸激酶 慢性髓性白血病,美國Epitomics公司成立于2001年9月，與加州大學舊金山分校(UCSF)及芝加哥 LOYOLA 大學聯(lián)手開發(fā)出新型雜交瘤技術，擁有兔單克隆抗體(RabMabs)技術的全球專利，是國際上唯一一家擁有兔類單抗技術的生物技術公司。,2012年3月

21、6日英國上市公司Abcam宣布將以1.7億美元收購全球唯一兔單株抗體蛋白生物技術公司Epitomics(F-宜佰) Epitomics,由于兔脾臟較大，可以進行更多的融合實驗，使得高通量篩選融合細胞成為可能。預期后10年數(shù)百種治療性抗體將被開發(fā)用于許多疾病的治療。,鼠單克隆抗體與兔單克隆抗體的比較,親和力更高:可以比鼠抗血清識別更多種類的表位識別表位更多: 能夠識別許多小鼠中不產生免疫的抗原特異性更高、檢測靈敏度更高、應用范圍更廣

22、、背景本底更低,漿細胞腫瘤,,基因工程抗體的制備,生物導彈的原理: 生物導彈是免疫導向藥物的形象稱呼，它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動導向，在生物體內與特定目標細胞或組織結合，并由其攜帶的藥物產生治療作用。,單克隆抗體具有高度專一性，能夠識別細胞表面抗原、各種受體、各種體液成分及細胞內和組織內的各種成分，能精確地瞄準和捕獲靶細胞，特異性地與靶目標發(fā)生反應，因而有“生物導彈”之稱。

23、 單抗體引導藥物或毒素到達抗原存在部位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用.從而減少藥物、毒素、同位素和酶在腫瘤治療過程中引起嚴重的副作用,大大提高治療腫瘤的效果。,用鼠單克隆抗體制備的生物導彈有什么問題？,雜交瘤是鼠來源的，因此產生的抗體也是鼠源的蛋白，對于人體而言是一種異種蛋白?！　‘惙N蛋白在人體內可能會引起免疫反應（哮喘、蕁麻疹/風疹塊，產生抗體等）或被排斥，有時會引起嚴重的致死性反應，因此自1980年代以來，如何解決生

24、物導彈的這個問題，一直是生物導彈在人體內應用的重要問題。,,,,,FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4,V區(qū),抗體基因的改造 將鼠源抗體的V區(qū)與人源抗體C區(qū)基因重組，獲得的嵌合體（chimerical antibody),可保留鼠抗體對抗原的高親和性，又減弱鼠抗原對人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。,解決方法,鼠單抗恒定區(qū)人源化,鼠單抗恒定區(qū)人源化,如何得到親和力高、特異

25、性強的抗體克??？,通過遺傳工程技術改造與生產抗體,抗體基因文庫 將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達載體（噬菌體）中，在原核細胞表達不同的抗體，形成一個抗體庫。 從這個抗體庫中， 用抗原可以篩選到相應的抗體基因。 優(yōu)點： 一是從不適合進行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得親和力高、特異性強的克隆抗體。,主要的抗原抗體反應,抗體效價的測定血清：血液凝固析出的淡黃色

26、透明液體 ，在凝血過程中，纖維蛋白原轉變成纖維蛋白塊，所以血清中無纖維蛋白原?？贵w效價(滴度，titer)：通過血清學方法能顯示一定反應的抗血清(或抗體)的最高稀釋倍數(shù)(或稀釋度的倒數(shù))。如終點稀釋度為1/100，則血清的效價(每1ml的血清中抗體效價)為100抗體單位的高低是衡量血清中抗體水平的一項檢測指標。,,試管凝集實驗（tube agglutination test）原理：大分子顆粒性抗原（細菌、紅細胞）與其相應的抗體相結

27、合，在適量的電解質存在及一定的溫度下，經過一定的時間可出現(xiàn)肉眼可見的凝聚團塊。一般以標準抗原測得免疫血清或患者血清中抗體的效價。,不加免疫血清,＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋：凝聚強度＋：出現(xiàn)凝聚－：無凝聚,抗體與多價抗原結合的濃度帶現(xiàn)象,抗體稀釋度應根據：①抗體效價高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；②一般講，應用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長。③抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時才能防止非特異性背景染色；抗體的稀釋

28、主要是指第一抗體，因為第一抗體中特異性抗體合適的嘗試是關鍵,應用高稀釋度第一抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應,減少或消除其中交叉抗體反應。,三、常見免疫分析方法 利用抗原與抗體特異性反應的特性對抗原或抗體進行量和質的測定分析。這類分析方法具有特異、靈敏和快速的特點。免疫沉淀,1. 環(huán)狀沉淀實驗：是溶液中的沉淀反應。在體外當抗體與相應抗原二者濃度比例恰當時，會發(fā)生免疫沉淀。,免疫監(jiān)測,免疫共沉淀(co-immunoprecip

29、itation)分離蛋白,人絨毛膜促性腺激素（HCG）的免疫監(jiān)測,尿液,膠乳,胎盤合體滋養(yǎng)層細胞產生大量的人絨毛膜促性 腺激素，可通過孕婦血液循環(huán)而排泄到尿中,人絨毛膜促性腺激素的免疫監(jiān)測-陰性對照,Co-IP工作示意圖,,,Co-immunoprecipitation,binding,wash,elution,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分離蛋白,Identifying specific protein

30、interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes,2.免疫雙擴散,抗原抗體在半透明的半固相介質中進行沉淀實驗。雙擴散是在瓊脂板中抗原和抗體分別從相鄰的孔中向四周擴散，在抗原孔和抗體孔之間二者比例合適的部位形成沉淀線。當兩個抗原完全一致時，兩條沉淀線完全融合；如果兩個抗原無共同抗原決定簇時，沉淀線互不干擾；當兩個抗原只是部分抗原決定

31、簇相同，還有其他不同的抗原決定簇，則沉淀線在后者一方形成突出的小刺,3. 免疫電泳 利用蛋白質在凝膠中電泳遷移率不同能被分離開來的特點與免疫擴散結合一起進行分析的方法。,1、 血清免疫電泳:雙擴散,,2、火箭電泳：為加速度的單向免疫擴散(抗原擴散,抗體不擴散)與電泳結合的一種方法,在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本后，將抗原置陰極端，抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當處發(fā)生結合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減

32、少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭?？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標本中的抗原含量。,常用于標記抗原的放射性同位素有 3H、125I、131I、 14C等。3H可以置換有機化合物中的氫，不影響原有化學性質，且半衰期長和能量低，便于防護。 125I的敏感度約比14C大3900倍。又因為125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易于標記，標記物。 標記方法簡便，多肽、蛋白質與小分子半抗原均可進行碘標記。一些不能直接用碘標記的半抗原，通

33、過接上一個酪氨酸亦可用碘標記之。,氯胺T直接標記法?！　÷劝稵是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。,發(fā)光免疫分析,用發(fā)光物質標記抗體。根據發(fā)光物的來源不同,有化學發(fā)光(chemiluminessence)和生物發(fā)光(bioluminescence)：化學發(fā)光供能反應為一般化學反應。指某種物質分子吸收化學能而產生的光輻射。例如化學發(fā)光劑如熒光醇（lum

34、inol）發(fā)生高能化學反應，形成處于電子激發(fā)態(tài)的分子，當回到基態(tài)時，伴隨光子的釋放，發(fā)生化學反應。,用于標記的酶的種類:堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase)辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase)b-半乳糖苷酶(b-galactosidase),廣泛使用,因酶促反應使測定的結果被放大,反應靈敏度高,b.間接法:用酶標第二抗體來檢查第一抗體是否與抗原結合, 避免了用酶標記每一種抗原或抗體

35、的復雜過程。,a.直接法:用酶標第一抗體來檢查第一抗體是否與抗原結合。,酶聯(lián)免疫分析法,生物發(fā)光是指生物體發(fā)光或生物體提取物在實驗室中發(fā)光的現(xiàn)象。它不依賴于有機體對光的吸收，而是一種特殊類型的化學發(fā)光，化學能轉變?yōu)楣饽艿男蕩缀鯙?00%。也是氧化發(fā)光的一種。生物發(fā)光的一般機制是：由細胞合成的化學物質，在酶的作用下，使化學能轉化為光能：蟲熒素（luciferin）在蟲熒酶（lucifase）的催化下，有ATP，Mg2＋及O2存在時，發(fā)生

36、瞬時發(fā)光反應。,Principle of Western blotting with Enhanced Chemiluminescence (ECL) detection system,免疫學在生物學中的應用,,,,,Indirect detection method,化學發(fā)光(chemiluminescent) 原理,發(fā)光液A和B分別是Luminol 和過氧化氫，在辣根過氧化物酶（HRP）的催化作用下,Luminol與過氧化氫反應生成

37、一種過氧化物，過氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會產生熒光。在發(fā)光過程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP沒降解失活,是可以重復加發(fā)光液的。但HRP作為一種蛋白酶,在室溫放置時間過長,是會降解的；同時在發(fā)光過程中有什么物質(比如顯影液)污染了膜的話,也有可能滅活膜上的HRP。,Lumigen PS3:化學發(fā)光檢測中與辣根過氧化物酶結合的底物 , produces a

38、more intense light emission of linger duration,樣品1,樣品2,電泳遷移率：在特定介質中單位電場強度的帶電顆粒電泳移動速度。電泳遷移率與顆粒所帶電荷量成正比，與顆粒的半徑和介質黏度成反比。實際工作中常用相對電泳遷移率，即兩種帶電顆粒在同一介質、同一電場中泳動距離之比。,一般情況下電泳中蛋白質分子量對數(shù)與遷移率呈線性關系 。,問題,單克隆抗體是如何制備的？什么是免疫共沉淀？Wester

39、n雜交試驗？,(熒光醇),(過氧酸 ,-O-O-),放射免疫分析：,免疫熒光分析: 將熒光化合物標記抗體。需要激發(fā)，才能發(fā)出熒光。,IRDye near infrared fluorescent dyes are setting new standards for protein and cellular assays, microscopy, and in vivo molecular imaging. These dyes

40、have excellent water solubility, near infrared (700-800 nm) emission wavelengths where autofluorescence is low, and minimal non-specific binding. Use IRDye infrared dyes for labeling nucleic acids, antibodies, proteins,

41、peptides, viruses, cytokines and chemokines whenever you need bright signal, low background imaging.,Li-COR,ChiP-to-Chip（染色質免疫沉淀分析和芯片）,染色質免疫沉淀分析Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP,膠電泳遷移率改變分析（EMSA）是目前研究轉錄調控蛋白和相應核苷酸

42、序列結合的常用方法，但是由于許多轉錄調控蛋白有相似或相同的DNA結合位點，這種體外分析獲取的結果不一定能真實地反映體內轉錄調控蛋白和DNA結合的狀況。染色質免疫沉淀分析（ChiP）是基于體內分析發(fā)展起來的方法，它能真實、完整地反映結合在DNA序列上的調控蛋白，是目前確定與特定蛋白結合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結合的蛋白質的最好方法。,DNA binding is reflected in changes in Cy-5/Cy