HPV16 E7蛋白免疫學(xué)特性研究及其單克隆抗體制備.pdf

1、本研究一方面擬探索HPVl6早期蛋白E7的免疫學(xué)特性，為以HPVl6 E7蛋白作為靶點(diǎn)的免疫學(xué)治療性疫苗研究提供線索，為HPVl6相關(guān)惡性腫瘤的免疫輔助治療提供依據(jù)；另一方面，以原核表達(dá)的HPVl6 E7-TRX融合蛋白為抗原，制備抗HPVl6 E7單克隆抗體，為HPVl6感染相關(guān)疾病的免疫學(xué)診斷提供線索。 方法 (1)從HPVl6陽(yáng)性的臨床標(biāo)本中克隆HPVl6E7基因，構(gòu)建HPVl6E7原核表達(dá)載體pET32／E7，調(diào)

2、整細(xì)菌表達(dá)溫度和IPTG作用濃度及誘導(dǎo)時(shí)間，優(yōu)化HPVl6 E7-TRX融合蛋白的表達(dá)條件并且對(duì)表達(dá)得到的蛋白以抗HPVl6 E7單抗隆抗體為材料采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，最后采用鎳離子層析吸附柱對(duì)原核表達(dá)的：HPVl6E7-TRX重組融合蛋白進(jìn)行純化。 (2)構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1／E7，并轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，采用G418對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1／E7的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行HPVl6 E7蛋白穩(wěn)定表達(dá)株的篩選，并且對(duì)

3、篩選得到的細(xì)胞株采用RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光染色方法進(jìn)行鑒定。 (3)將原核表達(dá)純化的HPVl6E7-TRX重組融合蛋白與福氏完全佐劑混合乳化，制成HPVl6E7蛋白免疫制劑。在對(duì)BALB／c小鼠采用弗氏完全佐劑免疫14d后，采用上述E7蛋白免疫制劑按100μg/ 次、每次間隔14d、共4次的免疫程序繼續(xù)對(duì)BALB／c小鼠進(jìn)行腹股溝皮下加強(qiáng)免疫接種，最后收集小鼠抗血清進(jìn)行雙向瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、EIJSA、免疫印跡實(shí)驗(yàn)和IFN-Y

4、檢測(cè)，分別檢測(cè)免疫小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫狀況；采用經(jīng)小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離純化的淋巴細(xì)胞進(jìn)行MTT試驗(yàn)和放射性同位素<'51>Cr摻入實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步體外檢測(cè)小鼠細(xì)胞免疫活性。 (4)取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2／0在融合劑聚乙二醇(PEG，MW4000)作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，緊接著采用HAT選擇性培養(yǎng)基對(duì)融合的細(xì)胞進(jìn)行篩選和亞克隆化培養(yǎng)，采用純化的HPVl6 E7-TRX蛋白和pET32a(+)空質(zhì)粒表達(dá)蛋白包被酶標(biāo)板，

5、經(jīng)EIJSA方法檢測(cè)各雜交瘤細(xì)胞分泌液抗體效價(jià)，傳代觀察所篩選的雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性，建立HPVl6 E7蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，并采用雜交瘤細(xì)胞接種BALB／c小鼠，收集并檢測(cè)腹水抗體的效價(jià)及結(jié)合效力，為HPVl6相關(guān)疾病的免疫學(xué)診斷提供線索。 結(jié)果 (1)以HPVl6陽(yáng)性的子宮頸細(xì)胞為標(biāo)本克隆得到了長(zhǎng)度為378bp的基因片段，其中第23～319nt處為HPVl6E7蛋白全部編碼序列。所構(gòu)建的HPVl6 E7原核表達(dá)

6、系統(tǒng)pET32／E7經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定得到了380bp左右的目標(biāo)小片段，而B(niǎo)amH Ⅰ和Xho Ⅰ單酶切均得到了6.3×10<'3>bp左右的單一目標(biāo)大片段。pET32／E7質(zhì)粒序列測(cè)定表明，所構(gòu)建的質(zhì)粒pET32／E7不僅沒(méi)有序列突變，而且其閱讀框架正確。原核表達(dá)質(zhì)粒pET32／E7在轉(zhuǎn)染BL21(DE3)菌株后，在1mmol／L IPTG、30℃誘導(dǎo)條件下，HPVl6E7-TRX融合蛋白獲得高效表達(dá)，在所觀察的誘導(dǎo)

7、表達(dá)19h范圍內(nèi)，蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，菌體內(nèi)目的蛋白以可溶性形式存在，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明所表達(dá)的HPVl6 E7-TRX融合蛋白與鼠源性抗HPVl6 E7多克隆抗存在有效結(jié)合，所形成的免疫沉淀線大約為39KD，其大小與21KD的硫氧還蛋白和18KD的HPVl6 E7蛋白分子量總和一致，而pET32a(+)空質(zhì)粒表達(dá)蛋白與這一抗體不能形成免疫沉淀線。 SDS-PAGE凝膠成像后灰度分析表明，融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白30％左

8、右。利用HPVl6E7-TRX融合蛋白上游含有的組胺酸標(biāo)簽可以與鎳離子結(jié)合的特點(diǎn)，采用Ni離子層析吸附柱純化得到了高純度的HPVl6E7-TRX融合蛋白。 (2)所構(gòu)建的pcDNA3.1／E7質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ別進(jìn)行雙酶切鑒定得到了396bp和5400bp的目的片段，但酶切反應(yīng)得到了5.8kb左右大小的單一片段。pcDNA3.1／E7質(zhì)粒序列測(cè)定表明，所構(gòu)建的質(zhì)粒 pcDNA3.1／E7不僅沒(méi)有序列突變，而且其閱讀框架正

9、確。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1／E7在轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，在250 μg／ml的G418作用下，經(jīng)30d選擇性篩選，得到了HPVl6E7基因NIH3T3細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，細(xì)胞株RT-PCR鑒定表明，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)存在HPVl6E7基因轉(zhuǎn)錄，RT-PCR得到了380bp左右的目標(biāo)條帶，也得到了大小為650bp左右的β-actin基因條帶，而對(duì)照細(xì)胞只得到β-actin 基因條帶，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pcDNA3.1／E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的N

10、IH3T3細(xì)胞核內(nèi)有熒光存在，而對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有熒光存在，表明 pcDNA3.1／E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了蛋白表達(dá)，蛋白表 達(dá)位置位于細(xì)胞核內(nèi)。 (3)采用HPVl6 E7-TRX蛋白制成的免疫復(fù)合制劑免疫BALB／c小鼠 后，雙向瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)得免疫血清滴度為1:32，ELISA檢測(cè) 血清最高稀釋倍數(shù)為1:2048，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明在39KD處出現(xiàn) 明顯的沉淀線，這一位置與大約21KD的硫氧還蛋白和18K

11、D的 HPVl6 E7蛋白組成的融合蛋白一致，表明所制備的鼠多克隆抗體 與目標(biāo)蛋白具有較高的特異性和敏感性，免疫的小鼠產(chǎn)生了良好的 體液免疫；IFN-γ檢測(cè)結(jié)果表明HPVl6 E7蛋白接種組INF-γ高達(dá) 303.75μg／ml，pET32a(+)空質(zhì)粒表達(dá)蛋白組116.18μg／ml，生理鹽 水對(duì)照組為95.46μg／ml，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組小鼠 MTTA490均值為2.85，PBS組和ConA．組分別為1.

12、0和1.82，三組 比較A490值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；放射性同位素?fù)饺朐囼?yàn)表明，在 效靶比分別為100:1、50:1和25:1時(shí)，HPVl6 E7純化蛋白免 疫BALB／c小鼠淋巴細(xì)胞和對(duì)照BALB／c小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1／E7質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞作用時(shí)，同位素<'51>Cr釋放率分別為36％、25％和22％對(duì)14％、9％和5％，在3個(gè)效靶比作用下差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1．對(duì)照質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)

13、胞<'51>Cr 釋放率分別為13％、11％、6％對(duì)12％、9.9和5.5％，而未轉(zhuǎn)染的 NIH3T3細(xì)胞這一數(shù)值分別為14％、8％、4.0％對(duì)以及13％、12％ 和6.4％，差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (4)所制備的雜交瘤182經(jīng)鑒定，雜交瘤182連續(xù)傳代120d，抗體分泌穩(wěn)定。所分泌的抗HPVl6 E7蛋白單克隆抗體(McAb E7)效價(jià)高，達(dá)1:100，Western Blot顯示McAb E7與原核表達(dá)的HPVl6 E

14、7-TRX重組蛋白在39KD目標(biāo)位置處有免疫沉淀?xiàng)l帶形成，而對(duì)照pET32a(+)空質(zhì)粒表達(dá)蛋白沒(méi)有條帶出現(xiàn)。 結(jié)論 (1)成功地從臨床標(biāo)本中克隆了HPVl6E7基因，建立了原核表達(dá)體系pET32／E7，并且pET32／E7在大腸桿菌中高效表達(dá)了HPVl6 E7-TRX重組蛋白，該蛋白融合蛋白主要由分子量大約為21KD的硫氧還蛋白和分子量大約為18KD的HPVl6 E7蛋白組成；硫氧還蛋白的融合表達(dá)既保證了所表達(dá)的外源蛋

15、白有正確的構(gòu)型，也增強(qiáng)了外源蛋白的免疫原性；E7蛋白上游含有6個(gè)組胺酸標(biāo)記，利用這一標(biāo)記，在鎳離子層析吸附柱作用下純化得到了高純度的HPVl6 E7-TRX重組融合蛋白。 (2)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1／E7，并轉(zhuǎn)染了NIH3T3細(xì)胞，在250μg／ml的G418作用下篩選得到了能夠穩(wěn)定表達(dá)HPVl6 E7蛋白的NIH3T3細(xì)胞株，為深入評(píng)價(jià)HPVl6 E7-TRX重組融合蛋白的免疫功能打下了基礎(chǔ)。 (3)

16、純化得到的HPVl6 E7-TRX重組蛋白在弗氏完全佐劑的輔助作用下對(duì)BALB／c小鼠產(chǎn)生了良好的免疫作用，免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)HPVl6 E7蛋白的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，也產(chǎn)生了表現(xiàn)為INF-Y增強(qiáng)的非特異性細(xì)胞免疫加強(qiáng)效應(yīng)，提示原核表達(dá)純化得到的HPVl6 E7-TRX重組蛋白是良好的治療性疫苗候選物質(zhì)。(4)成功地運(yùn)用以HPVl6 E7-TRX重組蛋白和pET32a(+)空質(zhì)粒表達(dá) 蛋白為抗原的免疫雙篩方法，制備了一株能分