HPV16 E7蛋白免疫學特性研究及其單克隆抗體制備.pdf

1、本研究一方面擬探索HPVl6早期蛋白E7的免疫學特性，為以HPVl6 E7蛋白作為靶點的免疫學治療性疫苗研究提供線索，為HPVl6相關惡性腫瘤的免疫輔助治療提供依據(jù)；另一方面，以原核表達的HPVl6 E7-TRX融合蛋白為抗原，制備抗HPVl6 E7單克隆抗體，為HPVl6感染相關疾病的免疫學診斷提供線索。 方法 (1)從HPVl6陽性的臨床標本中克隆HPVl6E7基因，構建HPVl6E7原核表達載體pET32／E7，調(diào)

2、整細菌表達溫度和IPTG作用濃度及誘導時間，優(yōu)化HPVl6 E7-TRX融合蛋白的表達條件并且對表達得到的蛋白以抗HPVl6 E7單抗隆抗體為材料采用免疫印跡實驗進行鑒定，最后采用鎳離子層析吸附柱對原核表達的：HPVl6E7-TRX重組融合蛋白進行純化。 (2)構建真核表達載體pcDNA3.1／E7，并轉染NIH3T3細胞，采用G418對轉染pcDNA3.1／E7的NIH3T3細胞進行HPVl6 E7蛋白穩(wěn)定表達株的篩選，并且對

3、篩選得到的細胞株采用RT-PCR和細胞免疫熒光染色方法進行鑒定。 (3)將原核表達純化的HPVl6E7-TRX重組融合蛋白與福氏完全佐劑混合乳化，制成HPVl6E7蛋白免疫制劑。在對BALB／c小鼠采用弗氏完全佐劑免疫14d后，采用上述E7蛋白免疫制劑按100μg/ 次、每次間隔14d、共4次的免疫程序繼續(xù)對BALB／c小鼠進行腹股溝皮下加強免疫接種，最后收集小鼠抗血清進行雙向瓊脂糖擴散實驗、EIJSA、免疫印跡實驗和IFN-Y

4、檢測，分別檢測免疫小鼠的體液免疫和細胞免疫狀況；采用經(jīng)小鼠淋巴細胞分離液分離純化的淋巴細胞進行MTT試驗和放射性同位素<'51>Cr摻入實驗，進一步體外檢測小鼠細胞免疫活性。 (4)取上述免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2／0在融合劑聚乙二醇(PEG，MW4000)作用下進行細胞融合，緊接著采用HAT選擇性培養(yǎng)基對融合的細胞進行篩選和亞克隆化培養(yǎng)，采用純化的HPVl6 E7-TRX蛋白和pET32a(+)空質(zhì)粒表達蛋白包被酶標板，

5、經(jīng)EIJSA方法檢測各雜交瘤細胞分泌液抗體效價，傳代觀察所篩選的雜交瘤細胞的穩(wěn)定性，建立HPVl6 E7蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株，并采用雜交瘤細胞接種BALB／c小鼠，收集并檢測腹水抗體的效價及結合效力，為HPVl6相關疾病的免疫學診斷提供線索。 結果 (1)以HPVl6陽性的子宮頸細胞為標本克隆得到了長度為378bp的基因片段，其中第23～319nt處為HPVl6E7蛋白全部編碼序列。所構建的HPVl6 E7原核表達

6、系統(tǒng)pET32／E7經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定得到了380bp左右的目標小片段，而BamH Ⅰ和Xho Ⅰ單酶切均得到了6.3×10<'3>bp左右的單一目標大片段。pET32／E7質(zhì)粒序列測定表明，所構建的質(zhì)粒pET32／E7不僅沒有序列突變，而且其閱讀框架正確。原核表達質(zhì)粒pET32／E7在轉染BL21(DE3)菌株后，在1mmol／L IPTG、30℃誘導條件下，HPVl6E7-TRX融合蛋白獲得高效表達，在所觀察的誘導

7、表達19h范圍內(nèi)，蛋白表達量隨時間延長而升高，菌體內(nèi)目的蛋白以可溶性形式存在，免疫印跡實驗表明所表達的HPVl6 E7-TRX融合蛋白與鼠源性抗HPVl6 E7多克隆抗存在有效結合，所形成的免疫沉淀線大約為39KD，其大小與21KD的硫氧還蛋白和18KD的HPVl6 E7蛋白分子量總和一致，而pET32a(+)空質(zhì)粒表達蛋白與這一抗體不能形成免疫沉淀線。 SDS-PAGE凝膠成像后灰度分析表明，融合蛋白表達量占菌體總蛋白30％左

8、右。利用HPVl6E7-TRX融合蛋白上游含有的組胺酸標簽可以與鎳離子結合的特點，采用Ni離子層析吸附柱純化得到了高純度的HPVl6E7-TRX融合蛋白。 (2)所構建的pcDNA3.1／E7質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ別進行雙酶切鑒定得到了396bp和5400bp的目的片段，但酶切反應得到了5.8kb左右大小的單一片段。pcDNA3.1／E7質(zhì)粒序列測定表明，所構建的質(zhì)粒 pcDNA3.1／E7不僅沒有序列突變，而且其閱讀框架正

9、確。真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1／E7在轉染NIH3T3細胞后，在250 μg／ml的G418作用下，經(jīng)30d選擇性篩選，得到了HPVl6E7基因NIH3T3細胞穩(wěn)定表達株，細胞株RT-PCR鑒定表明，轉染的細胞內(nèi)存在HPVl6E7基因轉錄，RT-PCR得到了380bp左右的目標條帶，也得到了大小為650bp左右的β-actin基因條帶，而對照細胞只得到β-actin 基因條帶，細胞免疫熒光實驗結果表明pcDNA3.1／E7質(zhì)粒轉染的N

10、IH3T3細胞核內(nèi)有熒光存在，而對照細胞沒有熒光存在，表明 pcDNA3.1／E7質(zhì)粒轉染的NIH3T3細胞內(nèi)發(fā)生了蛋白表達，蛋白表 達位置位于細胞核內(nèi)。 (3)采用HPVl6 E7-TRX蛋白制成的免疫復合制劑免疫BALB／c小鼠 后，雙向瓊脂糖擴散實驗測得免疫血清滴度為1:32，ELISA檢測 血清最高稀釋倍數(shù)為1:2048，免疫印跡實驗表明在39KD處出現(xiàn) 明顯的沉淀線，這一位置與大約21KD的硫氧還蛋白和18K

11、D的 HPVl6 E7蛋白組成的融合蛋白一致，表明所制備的鼠多克隆抗體 與目標蛋白具有較高的特異性和敏感性，免疫的小鼠產(chǎn)生了良好的 體液免疫；IFN-γ檢測結果表明HPVl6 E7蛋白接種組INF-γ高達 303.75μg／ml，pET32a(+)空質(zhì)粒表達蛋白組116.18μg／ml，生理鹽 水對照組為95.46μg／ml，3組比較差異有統(tǒng)計學意義；實驗組小鼠 MTTA490均值為2.85，PBS組和ConA．組分別為1.

12、0和1.82，三組 比較A490值差異有統(tǒng)計學意義；放射性同位素摻入試驗表明，在 效靶比分別為100:1、50:1和25:1時，HPVl6 E7純化蛋白免 疫BALB／c小鼠淋巴細胞和對照BALB／c小鼠淋巴細胞對穩(wěn)定轉染pcDNA3.1／E7質(zhì)粒的NIH3T3細胞作用時，同位素<'51>Cr釋放率分別為36％、25％和22％對14％、9％和5％，在3個效靶比作用下差異有統(tǒng)計學意義；對轉染pcDNA3.1．對照質(zhì)粒的NIH3T3細

13、胞<'51>Cr 釋放率分別為13％、11％、6％對12％、9.9和5.5％，而未轉染的 NIH3T3細胞這一數(shù)值分別為14％、8％、4.0％對以及13％、12％ 和6.4％，差異均沒有統(tǒng)計學意義。 (4)所制備的雜交瘤182經(jīng)鑒定，雜交瘤182連續(xù)傳代120d，抗體分泌穩(wěn)定。所分泌的抗HPVl6 E7蛋白單克隆抗體(McAb E7)效價高，達1:100，Western Blot顯示McAb E7與原核表達的HPVl6 E

14、7-TRX重組蛋白在39KD目標位置處有免疫沉淀條帶形成，而對照pET32a(+)空質(zhì)粒表達蛋白沒有條帶出現(xiàn)。 結論 (1)成功地從臨床標本中克隆了HPVl6E7基因，建立了原核表達體系pET32／E7，并且pET32／E7在大腸桿菌中高效表達了HPVl6 E7-TRX重組蛋白，該蛋白融合蛋白主要由分子量大約為21KD的硫氧還蛋白和分子量大約為18KD的HPVl6 E7蛋白組成；硫氧還蛋白的融合表達既保證了所表達的外源蛋

15、白有正確的構型，也增強了外源蛋白的免疫原性；E7蛋白上游含有6個組胺酸標記，利用這一標記，在鎳離子層析吸附柱作用下純化得到了高純度的HPVl6 E7-TRX重組融合蛋白。 (2)成功構建了真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1／E7，并轉染了NIH3T3細胞，在250μg／ml的G418作用下篩選得到了能夠穩(wěn)定表達HPVl6 E7蛋白的NIH3T3細胞株，為深入評價HPVl6 E7-TRX重組融合蛋白的免疫功能打下了基礎。 (3)

16、純化得到的HPVl6 E7-TRX重組蛋白在弗氏完全佐劑的輔助作用下對BALB／c小鼠產(chǎn)生了良好的免疫作用，免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對HPVl6 E7蛋白的特異性細胞免疫和體液免疫，也產(chǎn)生了表現(xiàn)為INF-Y增強的非特異性細胞免疫加強效應，提示原核表達純化得到的HPVl6 E7-TRX重組蛋白是良好的治療性疫苗候選物質(zhì)。(4)成功地運用以HPVl6 E7-TRX重組蛋白和pET32a(+)空質(zhì)粒表達 蛋白為抗原的免疫雙篩方法，制備了一株能分