PRRSV nsp1α單克隆抗體制備及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，它能干擾宿主Ⅰ型干擾素(IFN)的表達(dá)及Ⅰ型IFN介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而抑制感染豬的免疫反應(yīng)。PRRSV基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白1α(nsp1α)能抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，在PRRSV感染宿主細(xì)胞后的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。另外，nsp1α在PRRSV亞基因組的合成中也扮演著重要的角色，但具體機(jī)制尚不明確。本研究制備了PRRSV nsp1α的單克隆抗體，并將nsp1α基因

2、連接于慢病毒載體，然后在豬肺泡巨噬細(xì)胞傳代細(xì)胞系(PAM-3D4)中表達(dá)。提取宿主細(xì)胞的全蛋白后采用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量分析，共鑒定到1.2倍以上差異蛋白299個(gè)。此外，本文還探討了PRRSV編碼的nsp1α在調(diào)控宿主天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮的作用。主要研究如下:
　　1.PRRSV nsp1α蛋白的原核表達(dá)與純化
　　將PRRSV WuH3株的nsp1α基因插入原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-2

3、8a-nsp1α，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)nsp1α蛋白在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，并主要以不溶性包涵體形式存在。對(duì)包涵體進(jìn)行純化后得到濃度為0.64 mg/mL的nsp1α蛋白。
　　2.PRRSV nsp1α單克隆抗體的制備及亞型分析
　　用純化的nsp1α原核蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)ELISA篩選和3次克隆后共得到11株可持續(xù)分泌抗nsp1α抗體

4、的細(xì)胞株，分別命名為1A7、1A10、1C3、2D3、2E5、2E7、3B9、3E4、3E11、3G2、4E5。經(jīng)間接免疫熒光(IFA)和Western Blot檢測(cè)證實(shí)其中7株(2E5、2E7、3B9、3E4、3E11、3G2、4E5)與nsp1α具有良好的特異性反應(yīng)。亞型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這7株單抗的輕鏈均為kappa鏈，其中6株單抗(2E5、2E7、3B9、3E4、3E11、4E5)的重鏈為IgG1型，只有3G2株單抗的重鏈為IgG2a型。

5、
　　3.表達(dá)PRRSV nsp1α慢病毒的包裝及驗(yàn)證
　　為了研究nsp1α對(duì)PAM-3D4細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，將包含nsp1α的表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24 h和48 h分別收集細(xì)胞上清，用Western Blot和IFA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果都能檢測(cè)到目的基因的表達(dá)，并且確定了目的基因表達(dá)的最佳時(shí)間點(diǎn)為感染后72 h。
　　4.PRRSV nsp1α蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析
　　

6、將表達(dá)nsp1α的慢病毒感染PAM-3D4細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞樣品，提取細(xì)胞蛋白后采用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量分析，共鑒定到5126個(gè)蛋白，差異蛋白在1.2倍以上的有299個(gè)，其中上調(diào)113個(gè)，下調(diào)186個(gè)，這些差異蛋白涉及細(xì)胞生長與繁殖、天然免疫、信號(hào)通路等多方面的功能。本文也運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫、IPA蛋白分析軟件等對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位、功能聚類、網(wǎng)絡(luò)互作等分析，闡釋了nsp1α在病毒復(fù)制、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡方