PRRSV Nsp11單克隆抗體制備及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)PRRSV感染宿主時(shí)，豬的體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(I-IFN)來(lái)抵抗PRRSV的入侵，與此同時(shí)，病毒進(jìn)化出一系列逃避宿主免疫監(jiān)視的機(jī)制，達(dá)到免疫逃避的目的，目前免疫抑制機(jī)制尚不明確。PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白11(Nsp11)在抑制I-IFN產(chǎn)生的過程中扮演重要角色，但參與天然免疫其他信號(hào)通路過程了解甚少。本研究利用大腸桿菌BL21(D

2、E3)菌株表達(dá)具有細(xì)胞毒性的PRRSV Nsp11，并制備了Nsp11單克隆抗體;進(jìn)一步通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出PRRSV Nsp11引起宿主1.2倍差異表達(dá)蛋白434個(gè)，流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot實(shí)驗(yàn)說明Nsp11能夠引起PAM3D4/21細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。主要研究如下:
　　1.PRRSV Nsp11的表達(dá)及純化
　　為了優(yōu)化PRRSV Nsp11在大腸桿菌中的表達(dá)條件，將pET-30

3、a-Nsp11原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，并于誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以37℃、0.2 mM IPTG誘導(dǎo)30min的表達(dá)效果最佳，并且表達(dá)蛋白主要以可溶性形式存在，分子量約為32 kDa。經(jīng)Ni-NTA柱純化，獲得濃度為0.6mg/mL的純化蛋白。
　　2.PRRSV Nsp11單克隆抗體的制備
　　將純化后的Nsp11蛋白作為免疫原，免疫六周齡雌性BALB/C小鼠，經(jīng)過

4、細(xì)胞融合、ELISA篩選及細(xì)胞克隆，共獲得8株穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株，分別命名為1A4、1A9、1D1、4G9、5D8、5G1、1C10、5B11， IFA及Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中6株(1A4、1A9、1D1、4G9、5D8、5G1)能與PRRSV Nsp11發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　3.PRRSV Nsp11的亞細(xì)胞定位
　　將PRRSV接種Marc-145細(xì)胞，于接種后不同時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h、36h、4

5、8h)分別取樣，以PRRSV Nsp11單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果PRRSV感染時(shí)間的延長(zhǎng)，Nsp11的表達(dá)量逐漸增加，但在不同時(shí)間點(diǎn)均呈胞漿定位。
　　4.PRRSV Nsp11蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析
　　蛋白質(zhì)組學(xué)能在生物整體水平進(jìn)行高通量檢測(cè)分析，本研究利用Nsp11重組慢病毒感染PAM3D4/21細(xì)胞，經(jīng)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)處理分析后，共鑒定到蛋白5023個(gè)，引起1.2倍

6、差異表達(dá)蛋白434個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)蛋白184個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白250個(gè)。利用Western Blot對(duì)2個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白CAPN2和AAMP及1個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白CD63進(jìn)行分析，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)一致，從而證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。
　　5.PRRSV Nsp11引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡
　　Caspase3是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，蛋白質(zhì)組學(xué)和Western Blot驗(yàn)證了PRRSV Nsp11能夠上調(diào)caspas

7、e3的表達(dá)及活化。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)說明，PRRSV Nsp11能夠上調(diào)PAM3D4/21細(xì)胞凋亡比率，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)Nsp11能夠引起由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡關(guān)鍵分子CHOP的上調(diào)表達(dá)，Western Blot檢測(cè)到PRRSVNsp11促進(jìn)了GRP78、GRP94伴侶分子的上調(diào)表達(dá)以及eIF2α磷酸化，說明PRRSV能夠引起PAM3D4/21細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。PRRSV感染宿主細(xì)胞過程中能夠激活JNK信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡，Weste