晚期氧化蛋白產(chǎn)物單克隆抗體制備的實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用研究.pdf

1、本研究的目的是采用HAS與HOCI孵育體外制備AOPPs,通過葡聚糖凝膠Hitrap26/60 sephacryl S-300得到AOPPs的相對(duì)純品,取純化后的第一峰作為免疫原,并以純化后第一峰作為篩選抗體的檢測源,制備AOPPs的單克隆抗體,建立抗體工作平臺(tái),應(yīng)用AOPPs抗體通過Western blot、ELISA等方法觀察AOPPs在病變組織或體液中的表達(dá)情況,對(duì)相關(guān)疾病的診斷、療效觀察、預(yù)后提供依據(jù)等。另外,為用抗體中和AOP

2、Ps毒性、將AOPPs抗體偶聯(lián)透析器上,發(fā)揮靶向性治療作用以及AOPP結(jié)合蛋白甚至受體的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.首先通過葡聚糖凝膠Hitrap26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化HAS,經(jīng)變性、非變性電泳確定純化后白蛋白的分子量及純度。取純化的HAS與HOCL孵育體外制備AOPPs-HAS,再用Hitrap26/60 sephacryl S-300純化AOP

3、Ps-HAS。經(jīng)變性、非變性電泳、分子篩蛋白標(biāo)準(zhǔn)確定純化后AOPPs-HAS的分子量。并經(jīng)單核細(xì)胞株(THP-1)TNF-α分泌實(shí)驗(yàn)鑒定,純化后的AOPPs-HAS能否刺激單核細(xì)胞分泌TNF-α,促發(fā)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的活性。
　　 2.經(jīng)Sephacryl S300柱純化后.AOPPs-HAS分為6個(gè)峰,取純化后的AOPPs-HAS第1峰作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)制備抗AOPPs-HAS的McAb,用純化的

4、AOPPs-HAS和HAS分別作為篩選抗體的檢測源,選擇與AOPPs-HAS反應(yīng)呈強(qiáng)陽性而與HAS呈陰性的克隆,同時(shí)也選擇與AOPPs-HAS和HAS反應(yīng)呈強(qiáng)陽性克隆。亞類鑒定采用Sigma公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒。用Protein G柱純化抗體。SDS-PAGE鑒定抗體的純度。用間接ELISA、westernblot鑒定抗體特異性。
　　 3.標(biāo)記單克隆抗體,采用其中一株作為包被抗體,辣根過氧化物酶標(biāo)記的另一株作為標(biāo)

5、記抗體,通過配對(duì)試驗(yàn),篩選出最佳配對(duì),建立雙抗體央心法用于定量檢測人AOPPs抗原含量。優(yōu)化包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適宜工作濃度,并進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、檢測限等方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)。
　　 4.用此檢測系統(tǒng)檢測36例正常人,18例慢性腎衰但沒有透析的患者及56例透析患者之間血清AOPPs含量有無區(qū)別,并與分光光度計(jì)檢測的AOPPs比較。觀察離心前后兩種檢測方法對(duì)AOPPs的影響,比較分光光度計(jì)法與雙抗夾心法對(duì)AOPPs檢出陽性

6、率以及AOPPs與臨床其它指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)Hitrap26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化后HAS后分為3個(gè)峰,第三峰無論是變性電泳還是非變性電泳均只有一條帶且此條帶的分子量在55～72KD之間。表明從PAGE及SDS-PAGE看,經(jīng)純化后峰3為單一分子量的蛋白質(zhì),且其分子量約為67KD。用此純化的HAS與HOCL孵育體外制備.AOPPs-HAS并經(jīng)Se

7、phacryl S300柱純化后分為6個(gè)峰,PAGE及SDS-PAGE結(jié)果表明純化后的1、2、3、4峰表現(xiàn)為膠頂部的復(fù)合物,說明我們在制作AOPPs的過程中用的白蛋白是比較純的,而經(jīng)過HOCL處理后白蛋白發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的變化,變成了一個(gè)大分子的結(jié)構(gòu),故出現(xiàn)在膠的項(xiàng)部。但非變性電泳膠頂部的條帶比變性電泳明顯的多,而在變性電泳中,1、2、3、4峰在55～72KD處出現(xiàn)了比較明顯的條帶,說明此大分子的結(jié)構(gòu)在變性電泳時(shí)會(huì)有部分解聚,變成55～72

8、KD之間的蛋白,即解聚成白蛋白的單體,但大部分仍沒有解聚。分子篩蛋白標(biāo)準(zhǔn)鑒定其分子量為670KD。
　　 2.經(jīng)以上制備及純化后.AOPPs-HAS第一峰用分光廣度計(jì)法檢測其AOPPs含量為20.38μmol/l,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照HAS樣本的3.14lμmol/l。用純化后的AOPPs-HAS可顯著性誘導(dǎo)THP-1 TNF-a的分泌,未經(jīng)氧化修飾的HAS對(duì)THP-1的分泌沒有顯著性影響。時(shí)間效應(yīng)顯示AOPPs-HAS刺激6小時(shí),TH

9、P-1 TNFa的分泌量就已顯著性升高,12h升至最高水平。
　　 3.取純化后的AOPPs-HAS第1峰免疫BALB/c小鼠,共獲得3株穩(wěn)定分泌特異性抗.AOPPs的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1-C6、1-H1、3-A10,1株既抗HAS又抗AOPPs,命名為1-C5。亞類鑒定1-C5、1-C6、1-H1為IgG1,3-A10株為IgG2b。間接EIASA交叉反應(yīng)性分析顯示,其中1-C5既與AOPPs又與HAS特異結(jié)合,其

10、余三株均只與AOPPs特異結(jié)合,而與AOPPs-BSA、BSA、CD26親和力低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,均有顯著性差異(p＜0.01)。Western blot鑒定表明抗1-H1AOPPs-HAS抗體僅與AOPPs-HAS結(jié)合而不與HAS、AOPPs-BSA、AOPPs-RSA結(jié)合,且尿毒癥患者血清中AOPPs的水平明顯強(qiáng)于正常人。
　　 4.采用1-H1作為包被抗體,酶標(biāo)抗體采用1-C5McAb時(shí)為最佳配對(duì),成功建立了雙抗夾心法檢測人

11、AOPPs抗原系統(tǒng)。5μg/ml為包被抗體的最佳濃度,1:500為檢測抗體1-C5的最佳工作濃度。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限、方法回收率、方法的批內(nèi)和批間變異進(jìn)行了分析研究,結(jié)果顯示本方法最小檢出限為12ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線在20～300ng/ml范圍內(nèi)線性良好。批內(nèi)變異系數(shù)為4.8％,批間變異系數(shù)為7.17％,平均加樣回收率為98％,表明該方法準(zhǔn)確性高,重復(fù)性好,且實(shí)驗(yàn)步驟簡單,容易掌握,其敏感性完全能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。
　　

12、 5.分別用雙抗央心法、分光光度計(jì)法檢測36例正常人,18例慢性腎衰但沒有透析的患者及56例透析患者,發(fā)現(xiàn)HD組和CRF組血漿AOPPs水平顯著高于正常對(duì)照組,HD組明顯高于CRF組,P＜0.001。18例CRF患者用分光光度計(jì)法檢出16例高于正常,而用雙抗夾心法僅檢出10例AOPPs高于正常。56例HD患者用分光廣度法檢出51例高于正常,而用雙抗夾心法僅檢出42例高于正常。經(jīng)X2檢驗(yàn),具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分光光度計(jì)檢出AOPPs陽性率明顯高

13、于雙抗夾心法。高速離心后用分光光度計(jì)檢測尿毒癥患者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,而高速離心對(duì)雙抗夾心檢測AOPPs無明顯影響。兩種檢測方法呈明顯相關(guān)(r=0.543,P＜0.001,n=110),血漿AOPPs水平與血清肌配水平呈正顯著正相關(guān)(r=0.664,P＜0.001,n=110),與尿素氮呈顯著正相關(guān)(r=0.606,P＜0.001,n=110),與血色素呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.535,P＜0.001,n=110

14、)。
　　 結(jié)論:
　　 1.經(jīng)Hitrap26/60 sephacryl S-300 high Resolution純化后獲得了純品HAS,取此純化后的HAS與HOCL孵育體外制備AOPPs-HAS并經(jīng)Sephacryl S300柱純化后得到相對(duì)純品AOPPs-HAS,經(jīng)變性及非變性電泳鑒定表現(xiàn)為大分子的聚合物,經(jīng)分子篩蛋白標(biāo)準(zhǔn)確定其分子量為670kD。此純化蛋白能刺激單核細(xì)胞株。THP-1分泌TNF-α。
　　

15、 2.取純化后的AOPPs-HAS第1峰免疫BALB/c小鼠,成功篩選出3株穩(wěn)定分泌抗.AOPPs-HAS,1株既抗HAS又抗AOPPs-HAS的McAb雜交瘤細(xì)胞株。所分泌的抗體亞型3株為IgG1型,1株為IgG2b。間接ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)證明我們制備的抗體可以特異地和天然或經(jīng)HOCL與HAS處理后純化的AOPPs結(jié)合。
　　 3.用此單克隆單體配對(duì),建立了雙抗央心ELISA檢測系統(tǒng),對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢

16、出限、方法回收率、方法的批內(nèi)和批間變異進(jìn)行了分析研究,表明該方法準(zhǔn)確性高,重復(fù)性好,且實(shí)驗(yàn)步驟簡單,容易掌握,其敏感性完全能夠滿足臨床應(yīng)用的需要,可作為反映病人氧化蛋白損傷的一種檢測方法。
　　 4.雙抗夾心ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)HD組和CRF組血漿AOPPs水平顯著高于正常對(duì)照組,HD組明顯高于CRF組,P＜0.001。分光光度計(jì)檢出AOPPs陽性率明顯高于雙抗夾心法。經(jīng)X2檢驗(yàn),具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高速離心后用分光光度計(jì)檢測尿毒癥患

17、者血清AOPPs值明顯較未離心的AOPPs值低,而高速離心對(duì)雙抗夾心檢測AOPPs無明顯影響。兩種檢測方法具有很好的相關(guān)性。鑒于以上結(jié)果,我們考慮分光光度計(jì)檢出率高的原因可能是由于其缺乏特異性,導(dǎo)致假陽性,但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。
　　 5.本實(shí)驗(yàn)首次成功地大量純化AOPPs,制備了其單克隆抗體,建立了AOPPs單克隆抗體的工作平臺(tái),建立了雙抗夾心法檢測人AOPPs系統(tǒng),并應(yīng)用于臨床。目前國內(nèi)外均尚未有相關(guān)工作的報(bào)道。為下一步