HBsAg的單克隆抗體制備、表位分型及其應(yīng)用研究.pdf

1、臨床上,通過檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物來輔助判斷HBV感染與否,評(píng)價(jià)預(yù)后、治療方案和藥物反應(yīng)等。HBsAg是感染HBV后最早出現(xiàn)在血液中的標(biāo)志物之一,通常在肝臟組織產(chǎn)生生化指標(biāo)異?；虮憩F(xiàn)出黃疸癥狀前2-8周即可在血液中檢測(cè)到HBsAg。因此,在血液篩查和臨床診斷中,HBsAg是檢測(cè)HBV感染情況的首選指標(biāo)。HBsAg由HBV的S基因編碼,根據(jù)HBsAg表面抗原決定簇的不同,可以將其分為不同亞型,主要包括:adw、adr、ayw和ayr。共同決

2、定簇“a”存在于所有HBsAg,而d/y,w/r是兩對(duì)互斥決定簇。不同亞型具有明顯的地理分布特點(diǎn),并且與疾病的發(fā)生發(fā)展呈一定相關(guān)性,HBsAg血清型的臨床意義也是當(dāng)前HBV研究的熱點(diǎn)之一。在今后的HBV檢測(cè)項(xiàng)目中,如果能夠同時(shí)對(duì)HBsAg亞型進(jìn)行鑒定,將為疾病的治療方案和預(yù)后判斷提供非常有價(jià)值的參考。共同決定簇“a”存在于所有HBsAg中,因此成為免疫檢測(cè)和疫苗設(shè)計(jì)的最佳靶點(diǎn)。
　　 HBsAg的檢測(cè)方法有很多,主要是基于抗原-

3、抗體反應(yīng)的夾心ELISA方法。該方法具有成本低,操作簡(jiǎn)單、適用于大規(guī)模篩選等優(yōu)點(diǎn),是目前最為常用的檢測(cè)方法。近年來,相繼有新的檢測(cè)方法與技術(shù)問世,包括微粒子酶免疫分析,化學(xué)發(fā)光免疫分析等方法。總體而言,特異性好且敏感性高的HBsAg單克隆抗體始終是各種方法與技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)與前提。
　　 本研究著眼于我國(guó)HBsAg檢測(cè)水平與目前存在的問題,探討了高敏感性高特異性HBsAg單克隆抗體的制備與應(yīng)用,同時(shí)對(duì)HBsAg亞型單抗的制備進(jìn)行了

4、初步探索,主要包括以下三個(gè)方面的內(nèi)容:
　　 1.HBsAg共同決定簇“a”單克隆抗體的制備。分別用抗原HBsAg-ay和HBsAg-ad免疫兩組Balb/C小鼠,3次免疫之后檢測(cè)小鼠血清中HBsAg-ay或HBsAg-ad特異性抗體效價(jià)。選擇血清抗體效價(jià)較高的小鼠作為脾細(xì)胞來源,利用PEG作為融合劑將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。經(jīng)篩選獲得陽性雜交瘤細(xì)胞,利用有限稀釋法進(jìn)一步分選出分泌單一表位抗體的雜交瘤細(xì)胞,最終獲得5株

5、穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。對(duì)HBsAg-ay和HBsAg-ad抗原免疫獲得的抗體進(jìn)行交叉驗(yàn)證,篩選出共同決定簇“a”特異性抗體3株,分別為命名為＃3-11-2,＃3-16-1和＃6-2-2。
　　 2.共同決定簇“a”特異性抗體的功能分析與應(yīng)用研究。對(duì)2株親和力較好的抗體進(jìn)行亞型鑒定發(fā)現(xiàn),＃3-11-2為IgG2a,κ輕鏈:＃6-2.2為IgG1,κ輕鏈。利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)各抗體進(jìn)行表位鑒定。以特異性強(qiáng)、親和力好為原則從

6、中選擇出一組不同表位抗體,通過優(yōu)化參數(shù),確立了一個(gè)最佳的HBsAg檢測(cè)體系:0.8μg/mL,＃6-2-2包被,1:10,000稀釋＃3-11-2-HRP的檢測(cè)效果最為理想。以市場(chǎng)上廣泛認(rèn)可的試劑盒陽性對(duì)照品作為樣本,檢測(cè)本體系的有效性和靈敏性。進(jìn)一步利用優(yōu)選的一對(duì)＃6-2-2和＃3-11-2-HRP建立夾心ELISA檢測(cè)HBsAg方法,對(duì)正常人和乙肝患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),并且與臨床醫(yī)院應(yīng)用的檢測(cè)方法進(jìn)行比較,本研究中建立的體系表現(xiàn)出較

7、好的實(shí)際應(yīng)用能力。
　　 3.初步探索HBsAg血清型單克隆抗體的制備。在前期共同決定簇“a”特異性單抗制備工作的基礎(chǔ)上,探索HBsAg亞型單抗的制備。在第一部分中,HBsAg-ay和HBsAg-ad抗原免疫篩選到共同決定簇“a”特異性抗體的同時(shí),還有一部分抗體能且僅能與免疫抗原相互作用,在HBsAg-ay和HBsAg-ad之間無顯著交叉反應(yīng)。說明這些抗體是特異性識(shí)別“y”或“d”表位的。以此為原理,篩選到2株HBsAg“y”特