抗ATP5B單克隆抗體制備及其性質(zhì)研究.pdf

1、黃曲霉毒素B1是誘發(fā)肝臟癌變的主要因素之一。ATP合成β酶亞基(ATP5B)除參與機(jī)體各種能量代謝外，近些年國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)紛紛報(bào)道ATP5B還參與了腫瘤組織的信號(hào)調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)室前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)及熒光定量PCR研究分析了ATP5B蛋白與黃曲霉毒素B1誘發(fā)的肝癌演化存在相關(guān)性(ATP5B發(fā)生上調(diào))。本研究制備了分泌抗ATP5B單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5C4、6G11，為后期研究ATP5B參與黃曲霉毒素B1誘發(fā)肝癌的信號(hào)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。<

2、br>　　 本實(shí)驗(yàn)把已構(gòu)建的質(zhì)粒載體pET—28a(+)—atp5b和pET—32a(+)—atp5b分別轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)E．coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及Ni2+—NTA親和層析得到了純化的ATP5B—Trx、ATP5B蛋白，為制備抗ATP5B單克隆抗體提供了足量的免疫原及ELISA檢測(cè)所用的包被抗原。
　　 以重組蛋白ATP5B—Trx為抗原免疫BALB/c小鼠。經(jīng)四次免疫后，采用方陣法建立了間接非競爭

3、ELISA檢測(cè)體系，抗原ATP5B的最佳工作濃度為1：50，即為4．35μg/mL，lgG—HRP的最佳工作濃度為1：20000。之后以此檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定了小鼠血清效價(jià)(1A、2A小鼠效價(jià)達(dá)1：12800，1B、2B小鼠效價(jià)只到1：1600和1：6400，3A、3B小鼠效價(jià)還低于1：800)，同時(shí)采用間接競爭ELISA法評(píng)估了6只小鼠血清特異性，最終確定取BALB/c小鼠1A的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合(50％PEG1450)。

4、通過對(duì)雜交瘤細(xì)胞的篩選及數(shù)次亞克隆，最終獲得了2株分泌抗ATP5B單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5C4、6G11，其染色體條數(shù)約為98—102，均大于親本細(xì)胞。
　　 對(duì)雜交瘤細(xì)胞5C4、6G11進(jìn)行傳代、定期凍存復(fù)蘇，檢測(cè)其分泌抗體效果，結(jié)果證明雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)穩(wěn)定，其細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價(jià)分別為1：800、1：1600。采用小鼠腹內(nèi)誘生法制備單克隆抗體，經(jīng)辛酸—硫酸銨法、DEAE—纖維素離子交換柱層析純化后，此腹水抗體5C4、6G11