抗NMDAR2B(phospho Y1070)兔單克隆抗體制備及初步鑒定.pdf

1、背景：抗體從多克隆發(fā)展到單克隆抗體藥物，已被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)及醫(yī)藥研發(fā)技術(shù)產(chǎn)品中。相比鼠單克隆抗體而言，兔單克隆抗體具有高親和力，特異性強(qiáng)，易于人源化等優(yōu)點(diǎn)。n-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDARs)是壓力敏感型和配基偶聯(lián)的鈣離子通道，并在突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)紊亂等方面扮演重要角色，作為一種獨(dú)特的雙重門控通道(doubly gated channel)，它既受膜電位控制也受其它神經(jīng)遞質(zhì)控制。該受體被激活后，主要對(duì)Ca2+有通透

2、性，介導(dǎo)持續(xù)、緩慢的去極化過程。目前市面上主要是NMDAR2B的多克隆抗體，且其特異性和親和力并不是十分理想。
　　目的：制備NMDAR2B兔單克隆抗體。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了一段NMDAR2B多肽，YCA-13436多肽免疫三只實(shí)驗(yàn)兔。經(jīng)過血清blot實(shí)驗(yàn)初步篩選，將可能免疫了NMDAR2B兔脾細(xì)胞與240E兔骨髓瘤樣細(xì)胞株融合，產(chǎn)生能分泌NMDAR2B抗體的兔-兔雜交瘤細(xì)胞，用HAT作為選擇性培養(yǎng)基對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)

3、行培養(yǎng)，運(yùn)用ELISA法和WB法，篩選獲得陽性克隆，選取其中WB信號(hào)最強(qiáng)的克隆進(jìn)入抗體質(zhì)粒重組階段，再進(jìn)一步篩選，選取分泌單克隆抗體最強(qiáng)的配對(duì)進(jìn)入單克隆抗體大轉(zhuǎn)生產(chǎn)。
　　結(jié)果：YCA-13436的H1332號(hào)兔子免疫效果較佳，并進(jìn)入融合開發(fā)抗體，所得重組37-d抗體在多種裂解液中檢出特異性目的條帶，并能特異性地識(shí)別磷酸化蛋白而不能識(shí)別非磷酸化蛋白。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)一段NMDAR2B的磷酸化氨基酸序列，編號(hào)是YCA-