抗人胱抑素C單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、目的:制備抗重組人胱抑素C(cystatin C，Cys C)單克隆抗體，并測量其濃度，對其生物學(xué)性質(zhì)進行一個初步鑒定（包括免疫反應(yīng)性、亞型、效價、相對親和力、是否能與天然蛋白結(jié)合）。為進一步組裝CysC臨床測量試劑盒，以及探究Cys C的其他生物學(xué)作用打下牢固的基礎(chǔ)。
　　方法:以本實驗室原核表達的人Cys C重組蛋白免疫BALB/c小鼠，在聚乙二醇1500的作用下使小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0發(fā)生融合，采用有限稀釋法

2、篩選出穩(wěn)定分泌抗Cys C的雜交瘤細胞株（即陽性克?。?，向BALB/c小鼠腹腔注入雜交瘤細胞，抽取小鼠產(chǎn)生的腹水，采用proteinA親和層析柱純化腹水。測定單克隆抗體的濃度使用BCA法，測定單克隆抗體的免疫反應(yīng)性使用Western Blot，測定單克隆抗體的亞型、效價和相對親和力使用間接ELISA法。將辣根過氧化物酶(HRP)與單克隆抗體偶聯(lián)，重組蛋白作為抗原篩選出最佳配對抗體，并用雙抗夾心法測定天然Cys C蛋白。
　　結(jié)果:

3、運用經(jīng)典的單克隆抗體制備技術(shù)，篩選出了抗Cys C單克隆抗體的7株雜交瘤細胞，分別命名為4E3、4G2、4E2、4H2、4G4、8E1、8G4。向小鼠腹腔注入雜交瘤細胞，獲得了抗Cys C單克隆抗體濃度很高的腹水。proteinA親和層析柱純化腹水效果良好，測定已純化的抗體濃度最高的可達1.475mg/mL。7株單克隆抗體均有較強的免疫反應(yīng)性和較高的相對親和力，經(jīng)抗體亞型鑒定，其中5株為IgG1型，2株為IgG2a型。使用間接ELISA

4、法檢測自主研發(fā)的抗體效價均可達1∶104。采用雙抗夾心法，當8E1作為包被抗體，8G4作為酶標抗體的情況下，測得的OD值最高，使用此抗體對可以檢測出血清中的天然Cys C。
　　結(jié)論:(1)創(chuàng)建了抗重組人Cys C單抗雜交瘤細胞庫，經(jīng)有限稀釋法篩選得到了7株抗Cys C單抗雜交瘤細胞。(2)通過雜交瘤培養(yǎng)技術(shù)和小鼠腹腔注射制備了大量的單克隆抗體，純化后對其生物學(xué)性質(zhì)進行了初步鑒定，證明了其具有良好的抗體反應(yīng)性及親和力。(3)醫(yī)院收