鼠源性抗人腺病毒單克隆抗體的制備、鑒定及初步應用.pdf

1、人腺病毒(humanadenovirus，HAdv)是迄今發(fā)現(xiàn)的最大最復雜的無包膜的雙鏈DNA病毒之一。自50多年前首先被HillemanandRowe[1，2]分離以來，越來越多的研究揭示人腺病毒是引起急性呼吸道、胃腸道和眼部感染的病原。腺病毒的感染主要以區(qū)域性感染或爆發(fā)流行形式發(fā)生于兒童和招募的新兵中[3]。急性腺病毒感染一般為自限性疾病，但對于免疫功能抑制個體或免疫缺陷患者[4,5]，將會引起嚴重并發(fā)癥。尤其是7型、3型、2l型，

2、在兒童及軍隊中曾引起過嚴重的致死性肺炎[6，7]。過去幾年的研究發(fā)現(xiàn)，對于免疫功能抑制個體或免疫缺陷患者來說，腺病毒已日益被確認為具有高發(fā)病率及致死率的重要病毒病原體[3]。因缺乏有效治療藥物，腺病毒利用受損傷的免疫反應，這樣腺病毒急性或持續(xù)感染可致機體多系統(tǒng)損害，甚至危及生命。因此，獲取有中和活性的單克隆抗體(MAb)有望成為治療藥物，并在診斷和預防方面有重要意義。
　　研究目的：
　　本項實驗目的在于以人腺病毒3型抗原免

3、疫BALB/c鼠，用細胞融合技術制備具有中和活性鼠源性抗人腺病毒（HAdv）單克隆抗體（MAb）。采用中期分裂相秋水仙素阻抑法對MAb細胞株染色體進行分析，使用鼠MAb亞型鑒定試劑盒進行抗體亞型鑒定，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白質印跡方法（Westernblotting）和間接免疫熒光技術進行特異性鑒定。建立HAdv-3感染動物模型，用獲得的HAdv-3MAb進行保護性研究，從而為今后對人腺病毒的防治做實驗性的探索。

4、　　實驗方法：
　　1.雜交瘤細胞的建立：以活的人腺病毒3型（HAdv-3）滴鼻免疫BALB/c鼠，取血清效價大于1:8000的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，以病毒抗原包被，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測雜瘤細胞的上清進行篩選，陽性孔的雜交瘤細胞給予保留，經過有限稀釋法進行三次克隆化，得到能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
　　2.雜交瘤細胞特性分析：采用中期分裂相秋水仙素阻抑法對MAb細胞株染色體

5、進行分析。
　　3.單克隆抗體Ig類別、腹水效價及特異性鑒定：使用鼠MAb亞型鑒定試劑盒進行抗體亞型鑒定，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測腹水效價，蛋白質印跡方法（Westernblotting）和間接免疫熒光技術進行特異性鑒定。
　　4.建立HAdv-3感染動物模型，研究了獲得的HAdv-3MAb的體外中和活性及BALB/c小鼠感染HAdv-3的保護性作用。
　　實驗結果：
　　1.細胞融合率為86％，抗

6、體陽性孔率為51.4％。獲得1株能穩(wěn)定分泌抗HAdv單克隆抗體的雜交瘤細胞（1A4）。
　　2.用中期分裂相秋水仙素阻抑法分析1株雜交瘤細胞（1A4），染色體數(shù)為98條.
　　3.應用鼠MAb亞型鑒定試劑盒鑒定1株雜交瘤細胞（1A4），抗體亞類屬IgG2a/κ，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測該抗體腹水效價達10-5，蛋白質印跡方法（Westernblotting）結果發(fā)現(xiàn)該抗體特異性地識別HAdv-3感染細胞裂解物中相對

7、分子質量（Mr）約為116kDa六鄰體亞單位。間接免疫熒光結果顯示，1A4MAb特異性地識別HAdv-3感染的Hep-2細胞。
　　4.該MAb的體外中和效價達到1:128。對HAdv-3感染動物有保護性作用。
　　結論：
　　1.成功制備具有中和活性的鼠源性抗HAdv的單克隆抗體。
　　2.通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、蛋白質印跡方法（Westernblotting）和間接免疫熒光技術分析,該單克隆抗體具