人巨細(xì)胞病毒糖蛋白B單克隆抗體制備、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、研究背景:人巨細(xì)胞病毒(HCMV)在人群中普遍感染，對(duì)于免疫系統(tǒng)發(fā)育不全和免疫抑制患者可引起嚴(yán)重并發(fā)癥.包膜糖蛋白B(gB)是參與感染過程的關(guān)鍵蛋白，與病毒粘附、穿入宿主細(xì)胞及細(xì)胞間融合、傳播密切相關(guān)；是HCMV中和抗體的主要靶蛋白，亦是疫苗研究的主要候選蛋白。研究HCMV-gB及其抗體對(duì)闡明HCMV致病機(jī)制及疫苗的研制有重要價(jià)值。本課題通過篩選和合成gB中具優(yōu)勢(shì)免疫原性的氨基酸短序列，并制備單克隆抗體，為HCMV-gB功能學(xué)研究，闡明

2、HCMV致病機(jī)制和疫苗的研制打下基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?設(shè)計(jì)含優(yōu)勢(shì)免疫原性表位的HCMVgB多肽片段；獲得特異的gB單克隆抗體；將單克隆抗體初步應(yīng)用于gB抗原檢測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:以GenBank公布的Towne株、AD169株序列為基礎(chǔ)，篩選并合成兩條gB多肽(STRGTSATHSHHSS和SHATSSTHNGSHTS)；免疫Balb/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤融合技術(shù)制備出gB單克隆抗體；采用ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法

3、、免疫印跡、免疫沉淀等方法鑒定抗體性質(zhì)。將制備的單克隆抗體應(yīng)用于外周血白細(xì)胞樣本的gB抗原檢測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:制備得到單克隆抗體ZJU-FH6STRGTSATHSHHSS和ZJU-FE6SHATSSTHNGSHTS，分別為IgG1-κ和IgG2a-κ抗體亞型。經(jīng)間接ELISA法鑒定，ZJU-FH6效價(jià)為1:60000(初始濃度4mg/mL)；ZJU-FE6效價(jià)為1:240000(初始濃度1.2mg/mL)。免疫印跡和免疫沉淀

4、顯示ZJU-FH6和ZJU-FE6，均可識(shí)別變性的和天然的HCMVgB抗原。HCMV感染MRC-5的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，ZJU-FH6和ZJU-FE6可檢測(cè)Towne株和AD169株感染細(xì)胞的gB抗原。以制備的單克隆抗體檢測(cè)Allo-HSCT受者PBLs中的gB抗原，陽性率分別為79.1％和84.6％，平均陽性細(xì)胞數(shù)分別為6.20/5×104WBC和6.88/5×104WBC，均無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。單克隆抗體ZJU-F