禽戊型肝炎病毒衣殼蛋白單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、禽戊型肝炎(HEV)是由禽戊型肝炎病毒(Avian Hepatitis E Virus)感染所致的病毒肝炎,主要經(jīng)腸道傳播,臨床癥狀表現(xiàn)為為肝脾腫大,肝壞死,肝出血,卵巢退化,死亡率上升及產(chǎn)蛋率下降等。
　　 2001年,Haqshenas等從患有肝脾腫大(hepatitis-splenomegaly,HS)綜合癥的雞膽汁中首次分離出禽HEV。自禽HEV發(fā)現(xiàn)以來,對禽HEV血清流行病學(xué)的調(diào)查已有了數(shù)篇的報道,但由于禽HEV和人、

2、豬HEVORF2抗體的交叉反應(yīng),使得血清學(xué)的調(diào)查一直處于初級階段。禽HEVORF2基因序列同人、豬HEV的同源性為48-49％,其中ORF2蛋白中最保守的區(qū)域位于aa339-606。
　　 將本實驗室保存的禽HEV ORF2-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌原核表達禽HEV ORF2-1蛋白(aa339—564),經(jīng)過提純后免疫小鼠,經(jīng)常規(guī)的細胞融合和亞克隆制備出6株禽HEV ORF2-1蛋白的單克隆抗體(7H12,3E8,185,1H5

3、,3A1和6G8)。利用9段ORF2截短的蛋白(ORF2-1～9)和8個多肽,通過間接ELISA方法,確定6株單抗7H12,3E8,185,1H5,3A1和6G8分別識別aa339—355,aa355-384,aa355-384,aa384-414,aa389-398和aa510-516。3E8和185兩株單抗識別同一抗原表位區(qū)aa355-383,但這一抗原表位區(qū)含有28aa,為了區(qū)別3E8和185,將3E8用HRP標(biāo)記后做競爭ELIS

4、A,競爭ELISA結(jié)果顯示3E8和185兩株單抗識別兩個不相互重疊的抗原表位。
　　 2009年,趙欽等從中國患有大肝大脾的雞膽汁中首次分離出禽HEV,將中國株禽HEV攻毒SPF雞,采集攻毒后糞便、血清等。利用6株單抗采用免疫捕獲病毒方法去捕獲攻毒后糞便中的禽HEV,其中7H12和1H5兩株單抗可以捕獲到病毒,進一步通過免疫組化實驗證明7H12和1H5可以檢測到攻毒雞的器官中有禽HEV ORF2蛋白的存在。
　　 本實驗