豬戊型肝炎病毒V1蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定.pdf

1、戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的急性自限性疾病。其臨床特征為發(fā)熱、全身疲乏、食欲不振、厭油膩、惡心、嘔吐、尿色深黃如濃茶、眼睛和皮膚發(fā)黃，肝功能檢查山現(xiàn)轉氨酶迅速升高到幾百甚至幾千單位，黃疸較常見，并可持續(xù)1周。在亞洲、非洲和美洲等發(fā)展中國家人群中發(fā)生比較普遍，在一些地區(qū)可占到急性病毒性肝炎的50％，是導致發(fā)病和病死的重要因素，尤其對孕婦可造成有2056的病死率。由于在靈長類、嚙齒類以及各種家禽家畜體內也檢測到HEV抗體，提示其

2、可能為一種人畜共患病。HEV過去曾被認為是一種經腸道傳播的非甲-非乙型肝炎病毒。Balagan等用免疫電鏡技術從一名志愿受試者糞便中觀察到直徑為27～30nm的病毒樣顆粒，從而證實該病毒為新型的非甲非乙型肝炎病毒，1989年東京國際會議正式將這一類型的肝炎及其相關病毒分別命名為戊型肝炎和戊型肝炎病毒。HEV基因組為單股正鏈RNA，約7.5kb，具有3個開放讀碼框(ORF)。病毒基因組的5’端到3’端依次為5’端非編碼區(qū)(5’-NCR)、

3、ORF1、ORF3、ORF2、3’-NCR及polyA尾。HEV全球分布，危害嚴重。雖然HEV診斷方法不斷得到改進，但是安全有效疫苗的研制是控制HEV感染、預防HE發(fā)生的根本措施。明確HEV抗原表位是開發(fā)HEV診斷試劑和研制疫苗的基礎。國內外曾就重組蛋白和合成肽對HEVORF2編碼結構蛋白的免疫原性做了人量研究，發(fā)現(xiàn)在其羧基端集中了具有較強免疫反應性的主要抗原表位。ORF2編碼的農殼蛋白的上抗原表位數(shù)量多，結構復雜，其富含疏水區(qū)的C端2

4、/3部分存在多個免疫優(yōu)勢B細胞表位，包括能誘導中和抗體的抗原結合位點。因此本研究使用的免疫原是原核表達的含有swDQ株HEVORF2C端220個氨基酸殘基的V1蛋白，制備了6株針對V1蛋白的單抗，而通過單克隆抗體技術對HEV抗原表位進行深入研究，不僅有助于了解HEV抗原結構與功能的關系，而且對該病的診斷以及設計安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意義。 本研究首先構建了含swDQ株HEVV1蛋白的原核表達載體pET32a-V1

5、，并在大腸桿菌中進行了表達，利用HEV感染豬血清對表達產物進行Westernblot分析，證實表達的融合蚩白都具有較好的反應活性。然后以表達的融合蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠，最終共獲得了6株針對V1蛋白的單抗。利用肽掃描技術對6株V1蛋白的單克隆抗體(αC11、αC12、γH1、γF8、BC4、CH8)的抗原表位進行了研究。將V1蛋白基因分為兩個相互重疊的基因片段M1和M2，對6株抗V1蛋白的單抗進行鑒定，結果顯示有3株單抗既能特

6、異性識別M1又能識別M2的表達產物，說明這三株單抗所針對的表位位于M1和M2的重疊區(qū)，即位于ORF2492～500aa(HEVORF2編碼的病毒結構蛋白的492～500aa)；其余3株單抗中有兩株單抗僅能識別M1的表達產物，另外一株單抗僅能識別M2的表達產物。將片段M1(386-492aa)和M2(500-606aa)人工合成一套彼此重疊8個氨基酸長度為16個氨基酸的25個短肽，融合表達后與MAbs進行Westernblot和ELISA

7、反應性掃描，對3株單抗鑒定結果顯示，一株單抗與融合多肽E4和E5反應而不與其他短肽反應，說明這株單抗所針對的表位位于E4與E5的重疊區(qū)ORF2418～425aa(HEVORF2編碼的病毒結構蛋白的418～425aa)；有一株單抗能特異性識別融合多肽E1而不識別融合多肽E2，說明這株單抗所針對的表位位于E1與E2的不重疊區(qū)ORF2386～394aa(HEVORF2編碼的病毒結構蛋白的386～394aa)；另外一株單抗與融合多肽E24和E2

8、5反應而不與其他短肽反應，說明這株單抗所針對的表位位于E24與E25的重疊區(qū)ORF2588～595aa(HEVORF2編碼的病毒結構蛋白的588～595aa)。其中，表位418～425aa和表位492～500aa為首次發(fā)現(xiàn)。應用純化的表位融合蛋白對小鼠進行免疫，結果表明4個融合蛋白均能誘導小鼠產生針對短肽的特異性抗體。將純化的表何融合蛋白進行SDS-PAGE電泳，與抗swDQ株HEV豬血清進行Westernblot分析，結果表明這四個表