人-猴嵌合免疫缺陷病毒p27蛋白單克隆抗體抗原表位的鑒定.pdf

1、人/猴嵌合免疫缺陷病毒(simian/human/immunodeficiency virus,SHIV),是通過基因重組技術(shù),用HIV-1(hunman imrnunodeficiency viruses-1)的囊膜蛋白基因(env)和部分輔助基因與SIV(simian immunodeficieney viruses)相應(yīng)基因進(jìn)行置換,獲得的嵌合型病毒。SHIV具有親本HIV-1和SIV毒株相似的生物學(xué)特性,可以在非人靈長類(NHP

2、)動(dòng)物上模擬HIV-1感染,為研究HIV-1致病機(jī)制及疫苗開發(fā)提供了重要的模型。SHIV的衣殼蛋白p27構(gòu)成病毒粒子雙層殼的內(nèi)殼,而且與同屬病毒的衣殼蛋白具有相同或相似的抗原性,故可作為SHIV抗原檢測的標(biāo)志物。利用p27抗原和及其抗體,可以在細(xì)胞和機(jī)體水平對SHIV感染NHP模型進(jìn)行研究,為艾滋病疫苗研發(fā)、免疫策略的有效性以及相關(guān)基礎(chǔ)研究進(jìn)行評價(jià)。因此,鑒定p27抗原表位對于進(jìn)一步研究其蛋白結(jié)構(gòu)與功能、開發(fā)早期診斷試劑具有重要意義。<

3、br>　　 本研究用Protein A Sepharose CL-4B柱子對前期工作中已制備的3株p27蛋白單克隆抗體(monoclonal antibody,Mab)p27-A5、p27-C7和p27-D2進(jìn)行純化,通過ELISA相加試驗(yàn)對3株單克隆抗體進(jìn)行抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合試驗(yàn)。為了對3株單抗結(jié)合的抗原表位進(jìn)行精確鑒定,將該序列分為相互重疊15bp的3個(gè)基因片段,分別命名為p27-a(1bp～255bp)、p27-b(241bp～

4、495bp)、p27-c(481bp～741bp),根據(jù)每個(gè)片段的序列特征設(shè)計(jì)引物,并分別在三個(gè)基因片段中引入BamHⅠ及HindⅢ位點(diǎn)。將3個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增后酶切,并分別克隆于與經(jīng)相同酶切處理的表達(dá)載體pET-32a中,經(jīng)酶切和測序正確的重組質(zhì)粒,將其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析和Westernblot鑒定。在初步鑒定后,設(shè)計(jì)了一套總數(shù)為16個(gè)覆蓋整個(gè)免疫優(yōu)勢區(qū)域的短肽,分別命名為A1～A8、C1～C8,短肽長

5、度均為16aa,部分重疊,對其基因序列進(jìn)行了直接合成,在5’端和3’端分別引入BamHⅠ和HindⅢ位點(diǎn)。退火后與表達(dá)載體pET32a連接,以載體攜帶的His標(biāo)簽的融合方式,表達(dá)短肽,分別命名為A1至A8及C1至C8,表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Westernblot鑒定。
　　 本研究結(jié)果如下:1.應(yīng)用ProteinASepharoseCL-4B親和層析法成功純化3株單克隆抗體,獲得了高純度的IgG類抗體,3株腹

6、水單克隆體抗純度達(dá)95％以上,可以滿足作為檢測試劑和其他應(yīng)用研究的要求。2.確定了單抗p27-A5與p27-C7針對相同或位置相近抗原表位,而另一株單抗p27-D2針對與上述2株單抗不同的抗原表位。3.鑒定出以上3株單抗與p27結(jié)合的抗原表位,其中,單抗p27-C7及p27-A5所針對的抗原表位位于p27的61aa～76aa,氨基酸序列為61SEGCTPYDINQpMLNCV76;單抗p27-D2所針對的抗原表位位于p27的191aa～