鴨腸炎病毒VP22蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定.pdf

1、鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE），又名鴨瘟（Duck plague，DP），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鴨、鵝及多種雁形目動(dòng)物的一種急性、熱性及敗血性傳染病。其特征是流行廣泛、傳播迅速、發(fā)病和死亡率高。近年來(lái)在我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)較發(fā)達(dá)的地區(qū)發(fā)生流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于鴨瘟病毒的分子生物學(xué)研究比較滯后，目前還沒有建立針對(duì)鴨瘟的敏感而有效的分子生物學(xué)診斷方法。

2、而通過(guò)單克隆抗體技術(shù)對(duì)DEV主要的皮層蛋白VP22抗原表位進(jìn)行研究，不僅有助于了解VP22抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，而且對(duì)該病的診斷以及設(shè)計(jì)安全有效的基因工程表位疫苗等提供一定的參考依據(jù)。 本試驗(yàn)在進(jìn)行克隆并鑒定鴨腸炎病毒VP22（UL49）基因基礎(chǔ)上，將已經(jīng)構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-UL49轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中獲得表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的重組蛋白VP22進(jìn)行SDS-PAGE和Wester

3、n blot鑒定。結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白分子量約為36Ku，與預(yù)期的大小一致。重組蛋白能夠被鼠抗DEV陽(yáng)性血清所識(shí)別，表明該融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。將重組蛋白純化、復(fù)性后作為抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)間接ELISA、Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)行篩選及鑒定，最終獲得4株能夠穩(wěn)定分泌抗DEV VP22蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2810、2G1、3F10和3G2

4、。其單抗亞類分別屬于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM。Western blot實(shí)驗(yàn)表明這4株MAbs不僅能與重組的DEV VP22蛋白發(fā)生反應(yīng)，而且還能與DEV發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明4株MAbs都能夠識(shí)別天然構(gòu)象的VP22蛋白。因此，這4株單克隆抗體可作為DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位研究的工具。 為了進(jìn)一步研究DEV VP22表位結(jié)構(gòu)，首先設(shè)計(jì)了20個(gè)部分重疊且覆蓋VP22全長(zhǎng)的短肽融合蛋白，并在大腸桿菌BL21中