胰腺炎型鴨1型甲肝病毒VP1蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、本試驗(yàn)病原為胰腺炎型 DHAV-1(MPZJ1206株)，其所引起的病變與典型的DHAV-1有所不同，主要引起雛番鴨發(fā)生病變，發(fā)病的雛番鴨胰腺可見發(fā)黃和出血?將胰腺炎型DHAV-1與GenBank中登錄的DHAV-1相比，發(fā)現(xiàn)其VP1基因核苷酸同源性在94.1％與99.1%之間，VP1基因推導(dǎo)氨基酸殘基的同源性在96.8%與97.5%之間。
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)MPZJ1206株的VP1基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，并采用RT-PCR法將目的

2、VP1基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，將其連接到克隆載體pMD18-T上，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-VP1，并將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli Trans5α。挑取單菌落，雙酶切鑒定并測(cè)序，將鑒定為陽(yáng)性的菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收VP1片段，將其與表達(dá)載體 pGEX-6P-1進(jìn)行連接。并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，鑒定同上，將鑒定為陽(yáng)性的菌落經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。在此基礎(chǔ)上對(duì)V

3、P1蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，表達(dá)的目的蛋白大小為53kDa，與預(yù)期相符，且具有反應(yīng)原性，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5h蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，主要以包涵體的形式存在。
　　將誘導(dǎo)表達(dá)的VP1蛋白作為抗原免疫BALB/C小鼠，共免疫四次。同時(shí)建立檢測(cè)小鼠抗VP1抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。最后一次免疫后72h內(nèi)取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合后的雜交瘤細(xì)胞采用間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行亞克隆

4、，結(jié)果共獲得的2株雜交瘤細(xì)胞株均能穩(wěn)定分泌抗DHAV-1的VP1蛋白單克隆抗體，分別命名為1A2、5G3，并對(duì)其穩(wěn)定性，小鼠腹水的效價(jià)等進(jìn)行檢測(cè)?
　　本實(shí)驗(yàn)表明，兩株單克隆抗體具有穩(wěn)定性好，效價(jià)較高，特異性良好的特點(diǎn)。1A2株效價(jià)可達(dá)1：25×103，5G3株效價(jià)可達(dá)1：211×103。亞類鑒定結(jié)果顯示，兩株細(xì)胞均為IgG1、κ鏈抗體。Western-blot表明兩株單克隆抗體是針對(duì)DHAV-1的VP1蛋白?本實(shí)驗(yàn)獲得的單克隆抗