鴨甲肝病毒3型廣東分離株致病性及表達(dá)其VP1基因重組鴨腸炎病毒免疫效果的研究.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DVH)是由鴨肝炎病毒(DHAV)引起的主要危害1月齡以內(nèi)雛鴨的一種高度致死性疾病;DHAV分為DHAV-1、DHAV-2及DHAV-33個(gè)血清型;中國DVH主要由DHAV-1和DHAV-3引起;DHAV-3的出現(xiàn)及DHAV-1與DHAV-3的一同流行是中國DVH不能得到控制的主要原因。
　　鴨病毒性腸炎是由鴨腸炎病毒(DEV)引起的主要感染鴨、鵝等水禽的致死性傳染病;DEV屬皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科馬立克病毒屬，

2、其基因組較大且其感染具有宿主特異性，因此，以其為病毒載體構(gòu)建二價(jià)重組病毒活載體疫苗成為研究的熱點(diǎn)。
　　本研究的主要內(nèi)容包括兩方面，分別為DHAV-3廣東分離株的致病性的系統(tǒng)性研究及表達(dá)DHAV-3VP1基因的重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)。
　　1.DHAV-3致病性的研究
　　(1)DHAV-3毒力的鑒定
　　將分離于廣東的DHAV-3進(jìn)行鴨胚攻毒及雛鴨回歸試驗(yàn)，對(duì)該病毒感染致死雛鴨臨床癥狀、組織

3、病理變化及病毒載量進(jìn)行觀察及檢測，并測定該病毒的鴨胚半數(shù)致死量及雛鴨半數(shù)致死量，結(jié)果顯示，該病毒可快速引起鴨胚及雛鴨死亡且死亡率極高，剖檢觀察到肝臟、脾臟及膽囊出現(xiàn)嚴(yán)重的組織損傷，并引起雛鴨心、肝、脾、肺、腎、十二指腸及腦等組織器官出現(xiàn)不同程度的病理損傷，病毒拷貝數(shù)在肝臟中最高，脾臟次之，胸腺及肌肉中最低，且對(duì)11日齡鴨胚的LD50為10-5167/0.2mL，對(duì)5日齡雛鴨的LD50為10-6.375/0.2mL。
　　(2)雛鴨

4、感染DHAV-3后肝臟的轉(zhuǎn)錄組分析
　　以10LD50的DHAV-3感染5日齡雛鴨，利用RNA-Seq篩選病毒感染后12h及48h雛鴨肝臟中的差異表達(dá)基因，并對(duì)篩選獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類及KEGG信號(hào)通路分析;結(jié)果顯示，感染后12h和48h，肝臟中基因表達(dá)模式差異顯著，且感染后48h，大量的免疫相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)，并顯著富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用、Toll樣受體信號(hào)通路、RIG-1樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡及J

5、ak-STAT信號(hào)通路等。
　　(3)雛鴨感染DHAV-3天然免疫應(yīng)答相關(guān)分子的檢測
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)10LD50DHAV-3感染后3h、6h、9h、12h、24h、36h及48h雛鴨肝臟及脾臟中DHAV-3的病毒載量及12種免疫應(yīng)答相關(guān)分子的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，雛鴨感染DHAV-3后3h即可在肝臟及脾臟中檢測到低拷貝的病毒，肝臟中的12種免疫應(yīng)答分子的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，但脾臟中的表達(dá)呈現(xiàn)多樣

6、性;感染后6h～24h，雛鴨肝臟及脾臟中的免疫應(yīng)答分子的表達(dá)模式不同，隨著時(shí)間的延長，病毒拷貝數(shù)的大量累積，至感染后36h～48h，觀察到大多數(shù)免疫相關(guān)分子出現(xiàn)不同程度的表達(dá)上調(diào)，但最終雛鴨未能抵抗DHAV-3的感染而死亡。
　　2.表達(dá)DHAV-3VP1基因重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建
　　(1)DHAV-3全基因的克隆及其VP1蛋白抗原優(yōu)勢區(qū)的鑒定
　　根據(jù)GenBank已公布的DHAV-3參考序列，將DHAV-3基因組分

7、成6段相互重疊的片段，利用合成的簡并引物對(duì)DHAV-3的全基因序列進(jìn)行克隆;利用PCR方法克隆獲得DHAV-3VP1基因，并對(duì)該基因進(jìn)行分段截短表達(dá)，利用鼠抗DHAV-3多抗及雞源DHAV-3卵黃抗體對(duì)VP1蛋白的抗原優(yōu)勢區(qū)進(jìn)行篩選和鑒定，初步確定DHAV-3VP1蛋白的抗原優(yōu)勢區(qū)為90～175aa。
　　(2)含gpt篩選標(biāo)記的表達(dá)DHAV-3VP1基因的重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建、篩選及鑒定
　　將獲得的VP1基因克隆至pcD

8、NA3.1(+)中，擴(kuò)增獲得含CMV啟動(dòng)子、VP1基因及BHG pA的VP1表達(dá)盒基因，同時(shí)，以實(shí)驗(yàn)室保存的pMD18T-gpt表達(dá)盒質(zhì)粒為模板，利用PCR方法在原gpt表達(dá)盒兩端分別引入一個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，擴(kuò)增獲得gpt-loxP表達(dá)盒基因，通過一系列酶切、連接的方式成功構(gòu)建重組病毒轉(zhuǎn)移載體pEA SY-△Us10-gpt-loxP-VP1;將重組病毒轉(zhuǎn)移載體pEASY-△Us10-gpt-loxP-VP1與DEV C-KCE基因

9、組總DNA共轉(zhuǎn)染至原代鴨胚成纖維細(xì)胞中，經(jīng)11代霉酚酸加壓篩選及4輪蝕斑純化獲得含有g(shù)pt篩選標(biāo)記基因及DHAV-3VP1基因的重組鴨腸炎病毒，PCR鑒定正確后，將其命名為rDEV-△Us10-gpt-loxP-3-VP1。
　　(3)不合gpt篩選標(biāo)記的表達(dá)DHAV-3VP1基因的重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建、篩選及鑒定
　　將真核表達(dá)重組質(zhì)粒pKozak-NLS-Cre與重組病毒rDEV-△Us10-gpt-loxP-3-VP1

10、基因組總DNA再次共轉(zhuǎn)至DEF，在Cre酶的作用下，將兩個(gè)同向loxP位點(diǎn)間的gpt表達(dá)盒刪除，而僅保留一個(gè)loxP位點(diǎn)，利用PCR方法對(duì)重組病毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示存在不含gpt表達(dá)盒的重組病毒后，再進(jìn)行5輪蝕斑純化后得到純凈的、僅含單一loxP位點(diǎn)及VP1基因的重組DEV，經(jīng)PCR、RT-PCR、Western blot及IFA等試驗(yàn)鑒定正確后，將其命名為rDEV-△Us10-3-VP1;提取重組病毒rDEV-△Us10-3-VP1第

11、1、5、10、15及20代基因組總DNA，PCR均可擴(kuò)增到VP1基因，表明DHAV-3VP1基因可在DEV C-KCE基因組中穩(wěn)定存在;將rDEV-△Us10-3-VP1病毒液超離濃縮后進(jìn)行透射電鏡觀察，結(jié)果觀察到包含囊膜和衣殼的鴨腸炎病毒粒子形態(tài)。
　　3.動(dòng)物的免疫及攻毒
　　(1)產(chǎn)蛋鴨的免疫
　　以2×105、5×105及1×106PFU的重組病毒rDEV-△Us10-3-VP1及2×105PFU親本病毒DEV

12、 C-KCE免疫產(chǎn)蛋鴨，初次免疫后3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫。結(jié)果表明，血清中針對(duì)DEV及DHAV-3VP1的特異性抗體在加強(qiáng)免疫后的7d達(dá)到高峰，卵黃中，則在加強(qiáng)免疫后的14d達(dá)到高峰;血清及卵黃中特異性抗體效價(jià)與免疫劑量呈劑量依賴性;免疫后產(chǎn)蛋鴨血清及卵黃中的抗DEV中和抗體的變化趨勢與特異性性抗體的變化趨勢相似，而針對(duì)DHAV-3的中和抗體效價(jià)很低;免疫后產(chǎn)蛋鴨外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目均有所增加，但CD8+T淋巴細(xì)

13、胞增加幅度更高，免疫后7d CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比例下降，免疫后14d持續(xù)下降，直至免疫后21d接近正常水平。
　　(2)雛鴨的免疫及攻毒
　　以5×105PFU的重組病毒rDEV-△Us10-3-VP1單次免疫3日齡雛鴨，免疫后7d進(jìn)行DEVAV1222株強(qiáng)毒及DHAV-3強(qiáng)毒的攻毒，攻毒劑量為100LD50/只，逐日觀察并記錄雛鴨的臨床癥狀及死亡情況，結(jié)果表明，DEV強(qiáng)毒攻毒組雛鴨在攻毒后2周，重組病毒及親本毒免

14、疫的雛鴨均出現(xiàn)2只死亡，而PBS對(duì)照組雛鴨全部死亡，表明DHAV-3VP1基因的插入及DEVC-KCE US10基因的缺失，并不影響弱毒疫苗株DEV C-KCE為雛鴨提供免疫保護(hù)力以抵抗DEV AV1222株強(qiáng)毒的感染;而DHAV-3強(qiáng)毒攻毒組在攻毒后第4天，親本毒及PBS對(duì)照組雛鴨即全部死亡，重組病毒免疫組余1只雛鴨，攻毒后第8天，重組病毒組雛鴨全部死亡，表明構(gòu)建的表達(dá)DHAV-3VP1基因的重組鴨腸炎病毒不能夠?yàn)殡r鴨提供有效的保護(hù)力