表達(dá)鴨坦布蘇病毒E蛋白重組腺病毒的構(gòu)建及對雛鴨的免疫效果研究.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病是鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)引起的以產(chǎn)蛋下降、生長遲緩為主要特征的鴨新發(fā)傳染病，肉鴨及蛋鴨均能感染該病。該病群內(nèi)發(fā)病率能達(dá)到100％，死淘率為5％～15％。免疫接種是預(yù)防與控制該病的關(guān)鍵性措施之一，研制安全、有效，且能夠有效區(qū)分疫苗免疫和野毒感染的新型疫苗對該病的防控至關(guān)重要。
　　鴨坦布蘇病毒囊膜蛋白E蛋白構(gòu)成DTMUV的主要抗原表位，與病毒的吸附有關(guān)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗

2、體，引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。本研究首先構(gòu)建了表達(dá)DTMUVE蛋白的重組腺病毒疫苗，并對其免疫效果的進(jìn)行初步分析。根據(jù)鴨坦布蘇病毒AH-F10株(GenBank登錄號:KM102539)的E基因序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物。提取鴨坦布蘇病毒的RNA，并擴(kuò)增目的基因。將目的基因連接至穿梭載體pacAd-CMV K-NpA中。將PCR、酶切及測序鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒用PacⅠ酶線性化，之后與同樣經(jīng)PacⅠ酶線性化的骨架載體pacAd59.2-100

3、共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，包裝出重組腺病毒rAd-E。將rAd-E感染AAV-293細(xì)胞，連續(xù)傳代，均可產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變，表明rAd-E具有良好的遺傳穩(wěn)定性。檢測第8代重組腺病毒滴度，TCID50為10-6.17/0.1mL。間接免疫熒光和Western blotting試驗(yàn)結(jié)果表明，重組腺病毒可以在體外表達(dá)E蛋白，且該表達(dá)的重組E蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　應(yīng)用構(gòu)建的表達(dá)E蛋白的重組腺病毒載體進(jìn)行了免疫保護(hù)試驗(yàn)。將7日齡健康雛

4、鴨隨機(jī)分成4組，分別免疫重組腺病毒rAd-E，免疫劑量為108TCID50、鴨坦布蘇病毒病AH-F10株油乳滅活苗（陽性對照），免疫劑量為0.5mL、wtAd免疫劑量為108TCID50、PBS注射0.5mL，2周后用同等劑量加強(qiáng)免疫一次。免疫前后分別對各組試驗(yàn)鴨頸靜脈采血，分離血清，進(jìn)行DTMUV特異性抗體、中和抗體檢測，同時(shí)分離外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。二次免疫后2周進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。應(yīng)用DTMUVAH-TL15野毒株攻毒所有雛鴨

5、，攻毒劑量為0.5mL(ELD50為10-2.38/0.1mL)。記錄發(fā)病及死亡情況，并剖檢存活鴨只，制作病理切片。結(jié)果顯示，重組腺病毒rAd-E免疫雛鴨后1周可誘導(dǎo)鴨坦布蘇病毒特異性抗體的產(chǎn)生，抗體水平顯著高于PBS組和wtAd組，但低于陽性對照組;中和抗體滴度最高達(dá)到1∶16，低于陽性對照組，PBS組和wtAd組均未檢測到中和抗體。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示rAd-E組的刺激指數(shù)最高，陽性對照組次之，且兩組之間差異顯著(P＜0.05)

6、;IL-4和IFN-γ蛋白含量也顯著高于陽性對照組，表明重組腺病毒免疫組有效地誘發(fā)了細(xì)胞免疫反應(yīng)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)和HE染色結(jié)果顯示陽性對照組雛鴨的保護(hù)率達(dá)到100％，重組腺病毒的保護(hù)率達(dá)到80％，PBS組和wtAd組雛鴨全部發(fā)病。陽性對照組和重組腺病毒組的各組織沒明顯病變，PBS組和wtAd組的肝臟空泡變性、脾臟和胰臟淋巴細(xì)胞浸潤、腦組織有血管周圍袖套，有噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象。說明重組腺病毒載體疫苗對鴨坦布蘇病毒有較好的保護(hù)作用。
　　綜