雛鴨感染Ⅰ型鴨肝炎病毒相關(guān)基因的篩選.pdf

1、鴨病毒性肝炎(DuckViralHepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(DuckHepatitisVirus，DHV)引起的雛鴨的一種高度致死性的、傳播迅速的病毒性傳染病。該病以肝炎為主要特征，已呈世界性分布，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)鴨肝炎的研究主要集中在病毒基因組的測(cè)序、病毒的檢測(cè)方法及防治等方面，對(duì)DVH發(fā)病機(jī)制的研究不多，對(duì)病毒感染過程中機(jī)體的應(yīng)答機(jī)制，感染后引起雛鴨快速死亡的分子機(jī)制，機(jī)體細(xì)胞蛋白和病毒蛋白之間的

2、相互作用及其意義的研究，目前未見報(bào)道。為研究鴨肝炎的發(fā)病機(jī)制，本研究對(duì)DHV感染過程中鴨的差異表達(dá)基因進(jìn)行了探討。主要研究內(nèi)容如下： 1.雛鴨對(duì)DHV感染應(yīng)答基因的篩選與鑒定。 通過DHV感染雛鴨，建立了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。利用抑制性消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了雛鴨在DHV感染過程中肝、脾、腎、腦四種混合組織的正反向消減cDNA文庫。通過PCR從文庫中篩選出50個(gè)陽性克隆，經(jīng)序列測(cè)定共獲得10個(gè)差異表達(dá)基因。它們包括基質(zhì)Gla蛋白基

3、因(MGP)、溶菌酶G、淋巴細(xì)胞抗原復(fù)合物基因(LY6E)、黏液素4、β2微球蛋白和一個(gè)未知基因等6個(gè)表達(dá)上調(diào)基因；干擾素刺激基因12(ISG12)、細(xì)胞色素c氧化酶III、白細(xì)胞衍生的化學(xué)吸附素(LECT1)和染色體140RF100等4個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。這些基因的功能可以分為信號(hào)傳導(dǎo)、抗病毒免疫、電子傳遞等幾個(gè)方面。通過半定量RT-PCR對(duì)其中MGP、溶菌酶G、LY6E、ISG12、細(xì)胞色素c氧化酶III、LECT1和染色體140RF1

4、00等7個(gè)基因進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，這7個(gè)基因在雛鴨感染DHV過程中都是差異表達(dá)的。 2.ISG12基因的原核表達(dá)及其功能的生物信息學(xué)分析。 根據(jù)反向消減cDNA文庫中ISG12基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)含有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的引物，利用PCR擴(kuò)增ISG12基因片段，將ISG12基因片段連接到原核表達(dá)載體pGEX-KG中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-ISG12，使其在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達(dá)，SDS-