鴨瘟病毒gC基因疫苗在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相和分布規(guī)律.pdf

1、本研究圍繞鴨瘟病毒(DPV)的純化、DPVgC抗原檢測方法的建立和優(yōu)化、DPVgC基因疫苗（pcDNA-DPV-gC）在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相和分布規(guī)律及DPV弱毒疫苗在雛鴨體內(nèi)的增殖和分布規(guī)律等4個方面開展以下研究：①DPV的純化和超顯微結(jié)構(gòu)觀察：②特異性檢測DPVgC抗原的間接免疫組化和間接免疫熒光方法的建立和優(yōu)化；③將pcDNA-DPV-gC分別以每只6μg、3μg、1μg基因槍轟擊和200μg、100μg、50μg肌肉注射免疫2

2、0日齡的雛鴨；④將100μg脂質(zhì)體/DNA基因疫苗和殼聚糖/DNA基因疫苗以肌注、口服和滴鼻等不同免疫途徑免疫20日周齡的雛鴨；⑤在對照組中，將0.5mLDPV弱毒疫苗、100μg空白質(zhì)粒和0.5mL生理鹽水以皮下和肌注等不同免疫途徑免疫20日齡的雛鴨，免疫后不同的時間點(4h、12h、1d、3d、5d、7d、2w、4w、6w和10w)，隨機采集雛鴨的心、肝、脾、肺、腎、胰、腦、食道、胸腺、法氏囊、哈氏腺、十二指腸、盲腸、直腸和注射部位

3、等組織，通過建立的間接免疫組化和間接免疫熒光方法檢測pcDNA-DPV-gC在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相和分布規(guī)律及DPV弱毒疫苗在雛鴨體內(nèi)的增殖和分布規(guī)律。獲得結(jié)果如下：
　　 1.利用差速離心和蔗糖密度梯度離心法純化DPV，在電鏡下可觀察到多量、純凈的病毒粒子，純化DPV具有典型的皰疹病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)；將純化DPV抗原多次免疫家兔可獲得效價為1:32的兔抗DPV高免血清，經(jīng)飽和硫酸銨粗提和High-Q柱純化可獲得較純的兔抗DPVI

4、gG。
　　 2.建立的間接免疫組化和間接免疫熒光方法具有主觀，敏感性強，特異性高等優(yōu)點，是進(jìn)行DPVgC抗原檢測和定位的可靠方法，pcDNA-DPV-gC免疫后1d即可在雛鴨體內(nèi)檢測到DPVgC蛋白且持續(xù)表達(dá)至10w。
　　 3.基因槍轟擊和肌肉注射免疫pcDNA-DPV-gC在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相和分布規(guī)律：各劑量免疫組第1d在肝、十二指腸、盲腸、直腸和注射部位檢測到DPVgC蛋白，其中注射部位的陽性信號最強；第2

5、w時各組織中的抗原表達(dá)量達(dá)到高峰，隨著時間推移，陽性信號以不同速度逐漸衰減；第10w時各劑量免疫組仍在肝、法氏囊、腦、十二指腸、盲腸和直腸檢測到持續(xù)表達(dá)DPVgC蛋白；而胰在所有時間點均未檢出陽性信號；pcDNA-DPV-gC在不同組織的表達(dá)量也存在差異，肝、脾、法氏囊、腦、十二指腸、盲腸和直腸是DPVgC抗原主要的分布器官；陽性信號主要出現(xiàn)在肝臟的肝細(xì)胞、脾臟白髓或紅髓淋巴細(xì)胞、法氏囊皮質(zhì)或髓質(zhì)淋巴細(xì)胞、腦皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及腸黏膜上皮

6、細(xì)胞和固有層細(xì)胞等部位。
　　 4.脂質(zhì)體/DNA基因疫苗和殼聚糖/DNA基因疫苗在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相和分布規(guī)律：肌注組免疫后1d，肝臟、法氏囊、十二指腸、盲腸和直腸出現(xiàn)陽性信號；滴鼻組免疫12h，肺臟出現(xiàn)陽性反應(yīng)細(xì)胞，免疫后1d，哈氏腺和法氏囊檢測到DPVgC蛋白；口服組免疫雛鴨12h，食道出現(xiàn)中等強度的陽性染色，免疫后1d，法氏囊、十二指腸、盲腸和直腸檢測到DPVgC蛋白。其中肺臟、食道、哈氏腺、法氏囊、十二指腸、盲腸和

7、直腸陽性信號較強，且持續(xù)時間長。陽性信號主要出現(xiàn)在肺臟和食道的上皮細(xì)胞、法氏囊和哈氏腺淋巴細(xì)胞、腸黏膜上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞等部位。
　　 5.不同劑量pcDNA-DPV-gC在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相和分布規(guī)律：不同劑量pcDNA-DPV-gC免疫雛鴨后，各組織的抗原表達(dá)量呈現(xiàn)的總體規(guī)律為6μg組＞3μg組＞iμg組，200μg組＞100μg組＞50μg組，說明基因疫苗pcDNA-DPV-gC的免疫劑量與DPVgC抗原的表達(dá)和分布

8、呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，但非等比例增長。
　　 6.不同免疫途徑免疫pcDNA-DPV-gC在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相和分布規(guī)律：基因槍轟擊和肌肉注射免疫pcDNA-DPV-gC后，DPVgC抗原可在雛鴨體內(nèi)廣泛表達(dá)和分布。免疫早期，基因槍組各組織的DPVgC蛋白表達(dá)量大于肌注組，尤其是皮膚的DPVgC蛋白表達(dá)量高于注射部位肌肉；免疫中期，基因槍組和肌注組的陽性信號都有強烈的增加，肌注組略高于基因槍組，但差別不明顯；免疫后期，基因槍組和

9、肌注組各組織的陽性信號不斷減少，免疫后10w大部分組織檢測不到陽性信號。肌注、滴鼻和口服免疫脂質(zhì)體/DNA基因疫苗和殼聚糖/DNA基因疫苗后，陽性信號在雛鴨不同組織的分布也產(chǎn)生一定的差異，如滴鼻組哈氏腺的陽性信號比肌注組和口服組高，口服組食道的陽性信號比肌注組和口服組高，DPVgC抗原在雛鴨各組織中的表達(dá)量和持續(xù)時間的總體規(guī)律為肌注組＞滴鼻組＞口服組。
　　 7.不同免疫佐劑包裹的pcDNA-DPV-gC在雛鴨體內(nèi)的抗原表達(dá)時相

10、和分布規(guī)律：免疫佐劑脂質(zhì)體和殼聚糖都能促進(jìn)pcDNA-DPV-gC在雛鴨體內(nèi)抗原的表達(dá)和分布。殼聚糖/DNA組在雛鴨各組織中的陽性信號強度比脂質(zhì)體組更強，持續(xù)時間也比脂質(zhì)體組長。因此殼聚糖可作為pcDNA-DPV-gC免疫佐劑的首選。
　　 8.DPV弱毒疫苗在雛鴨體內(nèi)增殖和分布規(guī)律：DPV弱毒疫苗免疫雛鴨后，第12h肝臟和脾臟檢測到DPV抗原，隨著時間推移，陽性信號在1d～7d呈現(xiàn)上升趨勢，2w～4w達(dá)到最大值，但免疫后10w