鴨腸炎病毒糖蛋白gC基因的克隆、表達(dá)及部分功能的研究.pdf

1、鴨病毒性腸炎(duckvirusenteritis，DVE)，又名鴨瘟(duckplaguevirus)，是由鴨腸炎病毒(duckenteritisvirus，DEV)引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，曾在多個國家和地區(qū)發(fā)生流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。DEV是皰疹病毒科成員，第八次國際病毒分類報(bào)告將其劃分為皰疹病毒科未分類病毒屬。糖蛋白C(gC)是皰疹病毒的第二種主要囊膜蛋白，它對病毒的吸附、釋放和毒力起

2、著重要作用，而且能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。因此，對gC蛋白的研究不僅對病毒分子生物學(xué)功能特征有重要意義，而且在臨床診斷、疾病預(yù)防、基因工程疫苗研究也具有重要意義。 本研究以鴨腸炎病毒(DEV)C-KCE株基因組為模板，通過Tail-PCR.的方法擴(kuò)增了DEVC-KCE毒株未知的糖蛋白C(gC)基因及其兩側(cè)的序列，包括部分UL43同源序列、完整的ULA4同源序列(gC基因)以及與UL45基因之間的部分非編碼區(qū)，將其克隆到pMD18-T載

3、體上，構(gòu)建了pMD18-T-UL45-44和pMD18-T-UL44-43質(zhì)粒，并進(jìn)行了測序。DNA序列分析發(fā)現(xiàn)gC基因全長1296bp，編碼431個氨基酸，有兩個可能的啟動子和poly(A)信號；部分ULA3同源基因長600bp，編碼200個氨基酸。對gc基因進(jìn)行信號肽、糖基化位點(diǎn)(N-X-T/S)和跨膜區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，gC基因的1-22位氨基酸為其信號肽區(qū)域；1-398位氨基酸位胞外區(qū)，399-421位氨基酸為跨膜區(qū)，422-431位氨

4、基酸為胞質(zhì)區(qū)；有四個滿在的糖基化位點(diǎn)。與12株己報(bào)道的具有完整gC(UL44)同源基因序列的皰疹病毒參考株進(jìn)行比較，DEVC-KCEgC基因與α皰疹病毒gC同源基因有3個保守區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析DEV的gC基因，發(fā)現(xiàn)其與α-皰疹病毒亞科中禽的皰疹病毒親緣關(guān)系較近。 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pET30a(+)(E.coliRosetta)，對不含信號肽部分的gC基因胞外區(qū)進(jìn)行了原核表達(dá)，SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小為49kDa且

5、具有較高的表達(dá)水平，目的蛋白(His-gC)占菌體蛋白的比例為30％。His-gC融合蛋白是以包涵體的形式存在的。Western-blotting分析表明所表達(dá)的蛋白具有良好的抗原性。經(jīng)分離純化融合蛋白His-gC，制備了抗DEVgC蛋白的兔抗血清，并進(jìn)行了特異性鑒定，特異性良好。 以生長在蓋玻片上的CEF細(xì)胞中DEV病毒為抗原，以上述制備的兔抗DEVgC血清為一抗，進(jìn)行間接免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)熒光主要集中于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。