猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的克隆表達及間接ELISA方法的建立.pdf

1、猴B病毒(MonkeyBVirus)屬于α-皰疹病毒亞科,單純皰疹病毒屬成員,是一種以猴(特別是獼猴屬)為自然宿主的動物源性病原體。猴B病毒在其自然宿主中的感染率大于60%,但多呈隱性感染。該病毒感染非自然宿主(人和其他動物)的致死性強,感染病例的病死率超過80%,即使幸存也會留下失語、癱瘓等嚴重的神經(jīng)后遺癥。
　　 流行病學調查顯示,猴B病毒主要以接觸感染為主,被感染猴抓傷、咬傷都有可能感染猴B病毒,也有人傳人和蟲媒傳播等報道

2、。靈長類的人和猴感染猴B病毒后,一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn),表明病毒已侵入神經(jīng)系統(tǒng),治療便失去了意義。因此,建立快速鑒別診斷的方法,對猴B病毒早期的診斷與治療有重要意義。
　　 由于猴B病毒與在脊椎動物(包括人類)中廣泛感染的其他α-皰疹病毒(特別是人單純皰疹病毒,HSV)高度同源,表現(xiàn)出較強的交叉反應,因此,這類皰疹病毒成為了現(xiàn)階段猴B病毒快速鑒別診斷的主要障礙。由于受HSV和猴B病毒的感染特點等因素影響,目前所建立的猴B病毒檢測方法都

3、達不到快速、特異之目的。臨床醫(yī)學中常用狒狒皰疹病毒4(Herpesviruspapio2,HVP-2)、猴因子8(simianagent8,SA8)和HSV等病毒蛋白作診斷抗原檢測猴B病毒,但其檢測的靈敏度低。也有人研制了猴B病毒滅活疫苗,但該疫苗保護率低于50%。近年來,隨著對猴B病毒結構研究的不斷深入,特別是猴B病毒的全基因組測序的完成,囊膜糖蛋白(glycoprotein)逐漸成為猴B病毒診斷和防治研究的主要靶點。糖蛋白D和B是靈

4、長類動物受到α-皰疹病毒感染后免疫應答的主要標靶,gD和gB的抗體最先出現(xiàn)在急性或再發(fā)性人類HSV感染的血清中,并且達到很高效價,也可以保持2年之久。gB是導致靈長類皰疹病毒之間廣泛抗原交叉反應的主要原因,而gD中的氨基酸序列相對保守,推斷猴B病毒gD蛋白可以刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。
　　 鑒于猴B病毒囊膜糖蛋白在鑒別診斷過程中的重要作用,本試驗從以下方面展開工作:
　　 (1)比較猴B病毒與HSV-1和HSV-2三種囊

5、膜糖蛋白gB、gC和gD的同源性差異,分析猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因序列;(2)從中國源恒河猴B病毒的感染組織中克隆gD胞外區(qū)基因,分析其序列特征;(3)對目的基因——猴B病毒gD基因進行原核表達:(4)以純化后的重組gD蛋白為包被抗原,建立檢測猴B病毒抗體的間接ELISA法。
　　 1.猴B病毒囊膜糖蛋白生物信息學分析
　　 采用DNAMAN軟件比較猴B病毒、HSV-1和HSV-23種α-皰疹病毒中囊膜糖蛋白(gB、g

6、C和gD)的同源性差異,發(fā)現(xiàn)猴B病毒囊膜糖蛋白gB與HSV-1、HSV-2的同源性為78%、77%,gC與HSV-1、HSV-2的同源性為42%、48%,gD與HSV-1、HSV-2的同源性為56%、58%。有研究表明gB是導致靈長類皰疹病毒之間廣泛抗原交叉反應的主要原因,而gD中的氨基酸序列卻更加保守。本實驗室研究人員前期獲得了重組表達的猴B病毒囊膜糖蛋白gC并建立了gC-ELISA檢測方法,gC-ELSA的靈敏度和特異度分別為94.

7、1%和100%。因此,本試驗以猴B病毒囊膜糖蛋白gD作為研究對象。利用生物信息學方法對猴B病毒囊膜糖蛋白gD結構、親水性、表面可及性、抗原性指數(shù)、柔韌性以及B細胞表位等參數(shù)進行分析和預測,結果顯示:該蛋白的信號肽位于N端1-24氨基酸,胞外區(qū)位于N端25-341氨基酸,跨膜區(qū)位于N端342-364氨基酸,胞內(nèi)區(qū)位于N端365-394氨基酸;蛋白分子的柔性結構區(qū)域分布均勻,親水性較好,表面可及性較高:區(qū)段24～44、49～60、49～76

8、、107～118、141～150、164～174、206～214、287～308、322～339和365～382的平均性抗原指數(shù)分別為0.983、1.854、0.901、1.763、1.62、1.1、2.028、0.979、0.676和1.148,提示B細胞抗原表位在這些區(qū)段的可能性較大。本試驗最終選擇猴B病毒囊膜糖蛋白gD的胞外區(qū)作為篩選高效表達的抗原候選片段。
　　 2.猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因克隆及特征分析
　　

9、 根據(jù)NCBI公布的猴B病毒標準株E2490的全基因序列,以猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因胞外區(qū)為目的片段,利用BioXM2.6軟件分析該序列的酶切位點,發(fā)現(xiàn)該序列存在包括SmaⅠ、SacⅡ等在內(nèi)的203個常見酶,而NdeⅠ、HindⅢ等58個酶在該序列中未曾發(fā)現(xiàn),最終選擇NdeⅠ、HindⅢ為酶切位點,設計特異性引物,PCR擴增目的基因并將其克隆到pGM-T載體中,經(jīng)PCR和酶切鑒定后測序。PCR擴增得到約1000bp的目的基因,進一步分

10、析目的基兇序列發(fā)現(xiàn),擴增基因片段的核苷酸序列與猴B病毒標準株E2490的同源性為97.21%,GC含量為75%,呈區(qū)域集中分布,序列中含有20個稀有密碼子,占5.99%。比較猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的同源性,發(fā)現(xiàn)該基因與BV-MC1gDgene的同源性最高為98.6%,與HSV-1gDgene的同源性最低為61.7%。根據(jù)猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的同源性比對結果,下載與猴B病毒不同分離株及同源性較高的其它α-皰疹病毒相應的核苷酸序列

11、,用DNAStar進行系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)猴B病毒囊膜糖蛋白gD與BV-MC1gDgene親緣關系最接近,與HSV-2333gDgene的親緣關系最遠。
　　 3.猴B病毒囊膜糖蛋白gD的重組表達
　　 以猴B病毒全基因組為模板,通過PCR擴增獲得目的基因,經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定后插入原核表達載體pET-28b(+)中,構建了重組表達質粒pET-28b(+)-gD。將重組表達質粒轉化至E.coliBL21(DE3)中,

12、加入IPTG誘導表達,最終獲得48Ku以包涵體形式表達的gD重組蛋白,表達蛋白約占菌體總蛋白的35%左右。采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化(H)的蛋白,得到濃度為1.6mg/mL,、純度為94.8%(灰度掃描結果)的重組蛋白,經(jīng)透析除去其中的尿素和咪唑。純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳,以BIO-RAD半干轉移系統(tǒng)轉膜(PVDF)。表達產(chǎn)物的Westernblot結果表明重組gD蛋白能與猴B病毒陽性血清和抗His單克隆抗體特異結合,具

13、有良好的免疫原性,可作為猴B病毒血清學檢測的候選抗原。
　　 4.猴B病毒囊糖膜蛋白gD-ELISA法的建立
　　 基于重組gD蛋白為包被抗原,建立檢測猴B病毒抗體的問接gD-ELISA法。gD-ELISA的最佳工作條件為:抗原濃度為2μg/mL,血清稀釋度為1:8,封閉液為含8%兔血清的PBS,兔抗猴IgG-HRP的稀釋比例為1:25000,37℃避光顯色12min:陽性臨界值為OD450nm≥0.166。本試驗建立的

14、gD-ELISA法特異性良好,能有效區(qū)分BV與HSV。應用gD-ELISA與同室王代平建立的gC-ELISA和“金標準”——斑點免疫結合技術方法(DIA,美國VPL實驗室)分別對來自北京、四川的166份(北京90份,四川76份)猴血清樣本進行檢測,三者的陽性率分別為12.65%、13.25%和12.05%,其中北京90份猴血清樣本檢出的陽性率分別是13.33%(12/90)、13.33%(12/90)和12.22%(11/90),四川7

15、6份樣本檢出的陽性率分別是11.84%(9/76)、13.16%(10/76)和11.84%(9/76)。將gD-ELISA與“金標準”方法DIA進行篩檢試驗評價,篩檢試驗的真實性評價結果是gD-ELISA的靈敏度和特異度分別為95%和97.26%,其約登指數(shù)為0.9226,表明本次建立的猴B病毒gD-ELISA與猴B病毒“金標準”DIA方法的符合程度較高。篩檢試驗可靠性評價結果是觀察一致率P0為98.19%,機遇一致率Pe為78.35