鴨新城疫病毒HN蛋白單克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立.pdf

1、鴨新城疫，又稱為鴨副黏病毒病(Duck paramyxovirus disease，DPMV)是由禽副黏病毒Ⅰ型(APMV-Ⅰ)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，各日齡鴨均易感，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。新城疫病毒粒子囊膜表面包含兩種糖蛋白，分別是血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase protein，HN)和融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))。其中HN蛋白與病毒的毒力及致病性密切相關(guān)，

2、是主要的保護(hù)性抗原，在新城疫病毒(NDV)的研究中具有十分重要的意義。本研究以GenBank已公布的鴨源NDV SDWF02株HN基因序列（GenBank登錄號:HM188399）為模板，在其抗原位點(diǎn)分布較為豐富區(qū)域，設(shè)計(jì)并合成一對特異性引物，運(yùn)用RT-PCR的方法擴(kuò)增出鴨源NDV的HN基因片段，經(jīng)測序分析后，將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，制備出針對HN蛋白的單克隆抗體，為鴨源NDV的深入研究及臨床檢測提供了新途徑。
　　一、鴨源新

3、城疫病毒HN基因的克隆及分析
　　取實(shí)驗(yàn)室保存的鴨源NDV SDWF02株病毒，傳胚收集尿囊液，提取RNA，運(yùn)用設(shè)計(jì)的特異性引物，經(jīng)RT-PCR的方法成功擴(kuò)增出了NDV SDWF02株的HN基因片段，并將擴(kuò)增片段克隆至pMD18-T Vector載體中。經(jīng)測序分析，目的基因的核苷酸序列長度為822 bp，與鴨源NDV SDWF02株堿基序列一致。
　　二、NDV HN蛋白的表達(dá)及間接ELISA(HN-ELISA)的建立

4、>　　將含有的HN基因片段的陽性重組載體pMD18-T-HN經(jīng)SacⅠ和HindⅢ雙酶切，并將產(chǎn)物連接至pET-28a表達(dá)載體。再將含有HN基因片段的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta感受態(tài)細(xì)胞中，篩選含重組質(zhì)粒pET-28a-HN的重組菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白，SDS-PAGE分析表明，獲得的融合蛋白主要以包涵體的形式出現(xiàn)，分子量約為30.5 kDa，與預(yù)期大小相一致，選用Ni-NTA Resin對融合蛋白進(jìn)行純化，

5、Western blot結(jié)果顯示，該融合蛋白能夠特異性識別抗鴨NDV血清，具有良好的免疫原性。并利用純化的HN蛋白作為包被抗原，對抗原包被濃度、血清稀釋度及包被條件等進(jìn)行探索，建立出檢測鴨源NDV抗體的間接ELISA方法。
　　三、抗NDV HN蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
　　以NDV HN重組蛋白作為免疫原免疫Balb/c小鼠后，三次免疫后，經(jīng)加強(qiáng)疫取免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA方法檢測