犬瘟熱病毒F蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及抗原捕獲ELISA方法的建立.pdf

1、本研究以純化的犬瘟熱病毒(CDV)F蛋白免疫BALB/c小鼠，運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，用IFA、Western-blot對(duì)各株抗CDVF蛋白單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。結(jié)果獲得7株單克隆抗體具有對(duì)CDV的特異性，分別命名為:2D6，3E10，3A2，5B7，5F6，6H8，9B6;單抗亞類鑒定結(jié)果分別為IgG2a，IgG1，IgG2b，IgG1，IgG1，IgG2a和IgG1;各株腹水單克隆

2、抗體的ELISA效價(jià)為1∶2000～1∶16000;經(jīng)細(xì)胞中和試驗(yàn)初步證實(shí)2株單抗(5B7、9B6)具有中和犬瘟熱病毒感染Vero細(xì)胞的作用，中和效價(jià)分別為1∶320和1∶640;各株單抗親和力測(cè)定結(jié)果為:2D6＞6H8＞3E10＞5F6＞3A2＞9B6＞5B7;液相相加試驗(yàn)證實(shí)7株單抗的作用位點(diǎn)不同，其中2D6，5F6的作用位點(diǎn)非常相近。
　　 本研究采用飽和硫酸銨鹽析和Sephadex G-200柱層析法從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化C

3、DV，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，其濃度為1.292mg/mL。并以此為抗原免疫兔子，制備高免血清并提純IgG。兔抗CDV高免血清瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶32時(shí)收集血清，經(jīng)飽和硫酸銨鹽析和Sephadex G-50純化，兔抗CDV IgG蛋白濃度為8.246mg/mL。
　　 選取2D6和制備的CDV IgG建立了檢測(cè)CDV的抗原捕獲ELISA方法并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。兔抗CDV IgG、McAb、HRP-羊抗鼠最佳稀釋度分別為1∶3200、