豬流行性腹瀉病毒N蛋白單克隆抗體的研制與抗原捕獲ELISA抗體檢測方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是一種由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)主要為嘔吐、水樣腹瀉和脫水等，對哺乳仔豬的危害最嚴重，致死率高。我國從1976年開始有該病的報道，并且最近幾年流行的程度不斷加強，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。本研究采用桿狀病毒和大腸桿菌表達系統(tǒng)，構建獲得PEDV重組N蛋白，制備

2、成功4株N蛋白單克隆抗體，并利用其中一株單抗建立了抗原捕獲ELISA抗體檢測方法，為PEDV的診斷和血清學調查提供了重要工具。具體內容如下:
　　1.表達PEDV N蛋白的重組桿狀病毒的構建和鑒定
　　采用RT-PCR方法擴增獲得PEDV N基因，將其克隆到供體質粒pFastBac中，經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測序鑒定正確后，將重組供體質粒pFastBac-N轉化到含有穿梭載體Bacmid的DH10Bac感受態(tài)細菌中，經(jīng)過兩輪藍

3、白斑篩選和PCR鑒定后，獲得重組穿梭載體Bacmid-N。采用脂質體將其轉染至Sf9昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒。經(jīng)Westernblot鑒定，重組桿狀病毒可正確表達PEDVN蛋白，大小約為58KD。采用Ni-NTA親和層析方法獲得純化重組N蛋白，為PEDV診斷和亞單位疫苗研究奠定了基礎。
　　2.PEDVN蛋白單克隆抗體的制備與鑒定
　　采用RT-PCR擴增獲得PEDV N基因并克隆至原核表達載體pET-28a，轉化到宿主表

4、達菌BL21后經(jīng)IPTG誘導表達和Ni柱純化，SDS-PAGE和Western Blot鑒定結果顯示，重組N蛋白大小約為58KD。將純化的重組N蛋白免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細胞融合，PEDV N蛋白間接ELISA方法篩選，制備獲得4株能穩(wěn)定分泌N蛋白抗體的雜交瘤細胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和間接免疫熒光試驗證明其與PEDV和真核表達的N蛋白均有特異性反應，單抗亞類鑒定均屬于IgG1，輕鏈為κ型

5、。雜交瘤細胞培養(yǎng)上清ELISA抗體效價為1∶1600～6400，腹水ELISA抗體效價達1∶1.024105以上;4株細胞連續(xù)培養(yǎng)20代，其ELISA抗體效價基本一致，為PEDV診斷和致病機制研究提供了有用工具。
　　3.PEDV抗原捕獲ELISA抗體檢測方法的建立與應用
　　本研究采用PEDVN蛋白單克隆抗體包被酶標板，純化的PEDV作為捕獲抗原，成功建立了PEDV抗原捕獲ELISA抗體檢測方法，其優(yōu)化的反應條件為:單抗包

6、被濃度為2μg/mL，37℃包被2h加4℃過夜;5％脫脂乳的磷酸緩沖液作為封閉液，37℃封閉3h;捕獲抗原濃度為5μg/mL，37℃下作用3h;檢測豬血清1∶50稀釋，37℃作用1h;羊抗豬IgG-HRP稀釋度為1∶2000，37℃作用45min;底物最佳作用時間為37℃10min。采用S/P值作為判定標準，設定陰、陽性對照，根據(jù)公式計算S/P值:如果S/P值≥0.4時為陽性，S/P值＜0.3時為陰性，介于兩者之間為可疑。該ELISA方