豬流行性腹瀉病毒N蛋白和S蛋白單克隆抗體的制備及性質(zhì)鑒定.pdf

1、豬流行性腹瀉（PED）是由冠狀病毒科α冠狀病毒屬成員豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種高度接觸性傳染病。成年豬感染后并不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但感染仔豬會引起仔豬水樣腹瀉、脫水、嘔吐和高死亡率，導致巨大的經(jīng)濟損失。
　　本病尚無特效藥物和治療方法，因而制備其單克隆抗體用于診斷和治療很有必要。為此，本研究制備了針對S蛋白和N蛋白的單克隆抗體，并通過間接ELISA、間接免疫熒光等方法驗證了單克隆抗體的生物學特性，并初步探索了N蛋白單

2、克隆抗體在PEDV臨床診斷方面的應用和S蛋白單克隆抗體的中和活性，以期為進一步研究PEDV的治療方法奠定基礎。主要研究結果分以下三個方面：
　　一．PEDV N蛋白多克隆抗體的制備
　　用本實驗室保存的原核表達質(zhì)粒pET42b-PEDV-N-His進行PEDV N蛋白的大量表達純化，將PEDV N蛋白乳化后，頸背部皮下多點注射免疫清潔級日本大耳白兔，免疫六次后采集血清，得到PEDV N蛋白多克隆抗體，并用30％滅菌甘油分裝備

3、用。
　　間接ELISA、間接免疫熒光、Western Blot顯示該多克隆抗體可特異地識別PEDV N蛋白。
　　二．PEDV N蛋白單克隆抗體的制備及性質(zhì)鑒定
　　將PEDV N蛋白乳化后，腿部肌肉注射免疫SPF級Balb/c小鼠三次，加強免疫3天后取免疫小鼠脾細胞與SP2/0進行細胞融合，利用PEDV N蛋白進行間接ELISA和PEDV感染的Vero細胞進行IFA進行篩選，陽性細胞株使用有限稀釋法進行亞克隆，經(jīng)過

4、三輪篩選和亞克隆后，獲得5株針對PEDV N蛋白的單克隆抗體。
　　間接免疫熒光鑒定顯示N蛋白單克隆抗體株的特異性較強；Western Blot鑒定發(fā)現(xiàn)N蛋白單克隆抗體對于TGEV、PRV沒有交叉反應；雜交瘤細胞的染色體統(tǒng)計分析N蛋白雜交瘤細胞染色體數(shù)量在80-100條之間。間接ELISA檢測N蛋白單克隆抗體的腹水效價在102-104不等；純化腹水后，SDS-PAGE結果顯示每株單克隆抗體純度較高。
　　這些PEDV N蛋白

5、的單克隆抗體為進一步研究PEDV快速診斷方法奠定了基礎。
　　三．PEDV S蛋白單克隆抗體的制備及性質(zhì)鑒定
　　將S1-FC蛋白經(jīng)佐劑乳化后免疫Balb/c小鼠，三次腿肌注射免疫后，選取血清效價高的小鼠取脾細胞與SP2/0利用PEG誘導法進行細胞融合，用間接ELISA和間接免疫熒光方法和有限稀釋法經(jīng)過三輪篩選后，獲得13株針對S蛋白的單克隆抗體，其中6株S蛋白單克隆抗體具有中和活性。
　　間接免疫熒光鑒定顯示S蛋白單

6、克隆抗體株的特異性較強；雜交瘤細胞的染色體統(tǒng)計分析S蛋白雜交瘤細胞染色體數(shù)量在80-100條之間。間接ELISA檢測S蛋白單克隆抗體的腹水效價在102-105不等。利用實驗室保存的S1截短蛋白對S蛋白單克隆抗體進行抗原表位鑒定顯示針對1-253 aa片段（2株）、253-434 aa片段(2株)、477-533 aa片段(3株)、533-629 aa片段(1株)、629-789 aa片段（5株）。純化腹水并用BCA法測定濃度后，檢測這些