山東地區(qū)豬流行性腹瀉病毒感染情況調(diào)查及其單克隆抗體制備.pdf

1、自2010年10月起，豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）在中國(guó)嚴(yán)重爆發(fā)流行，之后，美國(guó)、墨西哥、加拿大、韓國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣等地也先后爆發(fā)不同程度的仔豬腹瀉，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究針對(duì)豬流行性腹瀉主要開(kāi)展了以下三個(gè)方面的工作：
　　1.山東地區(qū)豬流行性腹瀉感染情況調(diào)查
　　為了分析豬流行腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）在山

2、東地區(qū)的流行和遺傳變異情況，對(duì)2013-2015年收集的510份臨床腹瀉樣品，參照GenBank中已經(jīng)發(fā)表的PEDV毒株的N基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PEDV抗原，并對(duì)其中的16份陽(yáng)性樣品進(jìn)行病毒分離與S1基因測(cè)序分析。臨床檢測(cè)結(jié)果表明：PEDV臨床檢出率由2013年的57.8％提高到2015年的77.94%，PEDV在山東地區(qū)的發(fā)病季節(jié)除春冬季節(jié)，夏季也呈高發(fā)趨勢(shì)，且各地區(qū)均有不同程度的感染。S1基因序列分

3、析結(jié)果表明，16株P(guān)EDV分離毒株間的S1基因的核苷酸序列同源性為91%~99.8%，氨基酸序列同源性為87.8%~99.7%；山東分離毒株與15個(gè)國(guó)內(nèi)外參考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為90.5%~100%和88.4~99.9%。對(duì)S基因分子流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，20個(gè)國(guó)外參考毒株、25個(gè)國(guó)內(nèi)參考毒株與本次分離到的16個(gè)PEDV毒株被分為兩個(gè)不同的進(jìn)化分支G1和G2。在2013-2015年分離到的16株毒株中，有3株位于G1中，距離

4、CV777經(jīng)典毒株較近；其他的13株位于G2中，以近年流行毒株為主，而山東分離株主要在G2分支中，這也解釋了現(xiàn)有CV777疫苗毒株在山東地區(qū)的免疫保護(hù)力不佳的原因。本研究結(jié)果從分子流行病學(xué)角度分析了山東地區(qū)PEDV的流行和變異情況，為指導(dǎo)該地區(qū)PEDV防控提供了參考依據(jù)。
　　2. PEDV單克隆抗體的制備及鑒定
　　本研究將豬流行性腹瀉病毒變異株S蛋白上的一個(gè)抗原表位區(qū)（83~276aa）和N蛋白上的一個(gè)抗原表位區(qū)（126

5、~328aa）分別擴(kuò)增并連接到原核表達(dá)載體pET28a上，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-MtS和pET28a-N分別轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得以可溶性形式表達(dá)的S蛋白片段和以包涵體形式表達(dá)的N蛋白片段。將兩種重組蛋白片段純化后，分別免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)，篩選獲得兩株能穩(wěn)定分泌針對(duì)PEDV S蛋白抗原表位的雜交瘤細(xì)胞（分別命名為1E5和5B7）和三株能穩(wěn)定分泌針對(duì)PEDV N蛋白抗原表位的雜交

6、瘤細(xì)胞（分別命名為2E1、2B3和2B5）。
　　針對(duì)S蛋白的兩株雜交瘤細(xì)胞1E5和5B7細(xì)胞上清效價(jià)分別為1:125、1:100，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水ELISA抗體效價(jià)分別為1:12500和1:10000，單抗亞類鑒定均為IgG1，輕鏈均為κ型。Western Blot結(jié)果表明兩株單抗均能識(shí)別重組MtS蛋白；間接免疫熒光試驗(yàn)顯示，5B7與PEDV經(jīng)典毒株（CV777）和變異株均有反應(yīng)，而1E5只與PEDV變異株反應(yīng)，不與經(jīng)典毒株反

7、應(yīng)，結(jié)果表明這兩株單抗所識(shí)別的S蛋白抗原位點(diǎn)不同。
　　針對(duì)N蛋白的三株雜交瘤細(xì)胞2E1、2B3和2B5的細(xì)胞上清效價(jià)分別為1:256、1:128和1:128，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水ELISA抗體效價(jià)分別為1:12500、1:10000和1:10000，單抗亞類鑒定分別為IgG1、IgG2b、IgG2a類，輕鏈均為κ型。Western blot和IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示三株單克隆抗體均具有良好的反應(yīng)性和特異性。
　　3. N蛋白間接E

8、LISA的初步建立
　　本研究以純化的N蛋白作為包被原，建立了檢測(cè)PEDV血清抗體的間接ELISA。通過(guò)優(yōu)化各項(xiàng)反應(yīng)條件，最終將間接ELISA的反應(yīng)條件確定為：N蛋白抗原最佳包被量為1.5μg/mL，最佳包被條件為4℃包被過(guò)夜；最佳封閉液為5%脫脂奶粉37℃封閉1.5h；酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)條件為1:3000稀釋37℃反應(yīng)1h；被檢血清最佳反應(yīng)條件為1:100稀釋37℃反應(yīng)1.5h；底物最佳條件為室溫反應(yīng)15min。當(dāng)待檢血清OD4