豬δ冠狀病毒S蛋白和M蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是一種新發(fā)現(xiàn)的豬腸道冠狀病毒，感染引起豬腹瀉和嘔吐，臨床癥狀與豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea， PED）和豬傳染性胃腸炎（Porcine transmissible gastroenteritis，TGE）類似，但其發(fā)病率和死亡率相對(duì)較低，死亡率約為30％~50%。該病毒首次在2009~2010年香港冠狀病毒流行病學(xué)研究中被發(fā)現(xiàn)

2、，自2014年2月份在美國俄亥俄州豬腹瀉樣品中被檢出后，隨即在超過20個(gè)州及加拿大、韓國和中國等地相繼被報(bào)道出。PDCoV的爆發(fā)和流行嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，使得目前臨床上腹瀉病流行態(tài)勢(shì)更為復(fù)雜，給疫病防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。
　　本研究旨在制備PDCoV S蛋白和M蛋白單克隆抗體，為后續(xù)PDCoV基礎(chǔ)研究、流行病學(xué)調(diào)查和臨床上檢測(cè)、診斷方法的建立提供材料。
　　1．PDCoV S蛋白和M蛋白的原核表

3、達(dá)
　　以PDCoV CHN-HN-2014株RNA為模板通過RT-PCR擴(kuò)增獲得截短的S基因和全長的M基因序列，然后分別克隆到原核表達(dá)載體pET-30a(+)和pGEX-6P-1，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-tS和pGEX-6P-1-M。將兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)兩種蛋白都獲得高效表達(dá)，并均以包涵體形式存在，分子量大小分別約為60kDa和40kDa。純化的

4、重組S蛋白和M蛋白濃度分別為0.60mg/mL和0.53mg/mL。
　　2．PDCoV S蛋白和M蛋白單克隆抗體的制備
　　將原核表達(dá)并純化的PDCoV S蛋白和M蛋白作為免疫原分別免疫6周齡BALB/c雌性小鼠，取免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，運(yùn)用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的水平，并采用有限稀釋法進(jìn)行三次亞克隆篩選。經(jīng)過兩輪細(xì)胞融合共篩選到15株能夠穩(wěn)定分泌PDCoV S蛋白單克隆抗體的

5、雜交瘤細(xì)胞株；經(jīng)過一輪細(xì)胞融合篩選到13株能夠穩(wěn)定分泌PDCoV M蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）驗(yàn)證，PDCoV S蛋白15株單克隆抗體中有5株（分別為S2D6，S2E11，S2D8，S3B11和S4C7）IFA試驗(yàn)中有熒光，3株（分別為S2D6，S3B11和S4C7）Westren blot驗(yàn)證有特異性反應(yīng)；M蛋白13株單克隆抗體中有12株（分別為M1H3，M

6、3A5，M3D7， M3H9，M2H2，M2F8，M2G3，M1E2，M4B2，M4H12，M4E2，M4E1，M4C1）在IFA試驗(yàn)中有熒光反應(yīng)，13株單抗Western blot實(shí)驗(yàn)全部有特異性反應(yīng)。
　　3．PDCoV S蛋白和M蛋白單克隆抗體的初步鑒定
　　對(duì)獲得的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定和染色體計(jì)數(shù)等后續(xù)的研究工作。單抗亞型鑒定的結(jié)果顯示制備的單克隆抗體輕鏈均為K亞型，重鏈均為不同的IgG亞型。染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明，雜