人載脂蛋白M重組蛋白和單克隆抗體的制備及其初步臨床應用.pdf

1、背景：
　　 人載脂蛋白M(apol ipoprotein M，apoM)是新發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白，屬于疏水性分子結合蛋白家族，主要存在于HDL中。動物和細胞試驗的結果表明，apoM通過參與前β-HDL的形成，促進體內膽固醇逆轉運的過程，同時還具抗炎和抗氧化的作用。因此，認為apoM具有抗動脈粥樣硬化功效，但其抗動脈粥硬化作用機制目前還不十分清楚。由于apoM是一種小分子的載脂蛋白，分子量僅24kD，且成熟分子中的疏水信號肽介導該

2、蛋白“錨著”在磷脂單層上，直接從血清中提取apoM蛋白較困難。本研究擬通過基因工程手段，體外表達apoM重組蛋白，而制備抗apoM的單克隆抗體，為apoM蛋白結構和功能的研究打下基礎。
　　 目的：
　　 重組表達人全長apoM蛋白并將其純化，得到濃度高、純度好的重組apoM蛋白。
　　 方法：
　　 利用人類肝臟cDNA文庫做模板，聚合酶鏈反應(PCR)法擴增apoMDNA，將擴增正確的目的基因片段插入

3、載體pET相應位點，轉化大腸桿菌E coli JM109進行克隆，挑取陽性菌落進行基因測序；再用測序正確的質粒轉染大腸桿菌E. coli BL21(DE3)，IPTG誘導蛋白的表達；用親和純化的方法純化大腸桿菌表達的目的蛋白，并用SDS—PAGE凝膠電泳、Westren印跡及Lowry蛋白定量的方法對蛋白質的含量、純度及特性進行鑒定。
　　 結果：
　　 1、PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳證實擴增出一條特異的560bp的

4、基因片段，測序結果與GenBank公布的人apoM基因序列完全一致。
　　 2、成功構建了pET-apoM質粒。經BamH I和Xho I做雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)2條特異性的條帶，其中1條與酶切前質粒位置相近，另1條與目的基因大小基本一致。
　　 3、含重組質粒pET—apoM的大腸桿菌E. coli BL21(DE3)經IPTG誘導后表達重組蛋白，SDS—PAGE電泳分析表明在相對分子量34kD左右出現(xiàn)新的蛋

5、白條帶，與目的蛋白分子量一致。
　　 4、用親和層析的方法純化后的Trx-apoM重組蛋白，SDS-PAGE電泳表明純度高，無明顯雜帶。
　　 5、用抗Thioredoxin(Trx)抗體進行Western印跡檢測證實，該重組蛋白為Thioredoxin(Trx)融合蛋白。
　　 結論：
　　 本研究成功克隆出人apoM基因，并表達出Trx-apoM重組蛋白。通過克隆表達人apoM蛋白，一方面可以將其作為

6、抗原制備針對apoM的抗體，從而可以進一步開發(fā)人體血液中apoM含量的檢測試劑盒，為臨床研究和診斷提供工具；另一方面，可以對表達的apoM進行理化處理，在細胞和動物模型上對apoM的功能進行研究，從而進一步研究apoM在人體脂類代謝中的生理功能。
　　 背景：
　　 載脂蛋白M(apoM)由于其基因結構和組織分布特點，被認為其可在抗動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用；對該蛋白結構及功能的認識，有助于揭示其抗動脈粥樣硬化作用的機制

7、，從而對疾病的預防及治療起著重要的推動作用?？贵w作為研究工作中的探針，可以從分子、細胞和器官等不同水平上，研究抗原物質的結構與功能的關系；還能作為親合層析的配體，固定在層析柱上，通過親合層析從復雜的混和物中分離、純化某種蛋白，是蛋白質功能研究的基本手段。利用雜交瘤技術制備抗體，是生物學和醫(yī)學研究領域常用的方法；單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結合的特異性強，便于人為處理和質量控制，來源容易等特點，使它的應用一直廣泛地受

8、到關注。血清中apoM蛋白分子量小，與脂蛋白結合緊密，物理方法不易分離，我們在前期研究中制備了高純度的重組Trx—apoM蛋白，為單克隆抗體的制備提供了基礎。
　　 目的：
　　 制備親和力高、純度好的apoM單克隆抗體，并對抗體的濃度、免疫球蛋白亞類、相對親和力和特異性進行分析鑒定。
　　 方法：
　　 用重組Trx—apoM蛋白免疫Ba1b/c小鼠，經細胞融合、篩選及克隆化，得到三株生長良好，分泌穩(wěn)定

9、的雜交瘤細胞株；腹腔注射于Ba1/c小鼠，收取腹水，純化后得到三個抗apoM單克隆抗體。純化后的抗體經12％SDS—PAGE電泳觀察純化效果；用抗體亞類測定試劑盒檢測單抗免疫球蛋白亞類；通過直接法ELISA相加試驗判斷三株單克隆抗體的抗原識別位點；用直接ELISA法測定三株亞克隆抗體的相對親和力；用間接法ELISA阻斷試驗判斷單克隆抗體的特異性；用免疫熒光和免疫組織化學的方法判斷單克隆抗體與細胞和組織的反應特性；用Westren印跡法比

10、較單克隆抗體與重組Trx—apoM蛋白、人血漿蛋白的反應。
　　 結果：
　　 1、得到了三株分泌穩(wěn)定、生長良好的亞克隆雜交瘤細胞株。用該三株雜交瘤細胞接種小鼠得到的腹水單抗效價達到了1:106～1：107。
　　 2、經亞型鑒定結果顯示三株mAb均為IgG2ak。
　　 3、1E2F12和8F12C6兩株單抗識別抗原的位點不同，1E2F12特異性結合的抗原位點也不同于14H187；同時結合抗原的能力1E

11、2F12/8F12C6強于1E2F12/14H1B7。
　　 4、三株單克隆抗體親和力由大到小次為1E2F12>8F12C6>14H1B7。
　　 5、阻斷試驗顯示三株抗體均具有較好的特異性。
　　 6、Western印跡實驗檢測重組Trx—apoM蛋白與單克隆抗體的反應情況，在約34kD處三株單抗均有特異性條帶，與預測的分子大小位置符合，背景清楚。
　　 7、與正常人肝細胞裂解液和混合人血清的Weste

12、rn印跡實驗中，在分子量24kD處有特異性條帶出現(xiàn)。
　　 8、用制備的單抗檢測apoM在不同種屬細胞中的表達，表明在人正常肝細胞、猴腎細胞中呈陽性表達。
　　 9、用三株單克隆抗體檢測人組織中apoM蛋白表達，發(fā)現(xiàn)在人肝組織細胞漿及人胰腺組織導管上皮細胞漿、膜中呈陽性表達，在心、肺、脾、大腸和小腸組織中未檢測到該蛋白的表達，符合率達100％。
　　 結論：
　　 成功制備了三株抗apoM的單克隆抗體，不

13、僅能與重組蛋白反應，還可與人體內的天然蛋白結合，是國內首次報道制備出了針對人血清天然apoM蛋白的鼠抗人單克隆抗體，為下一步定量檢測人血清中apoM蛋白含量打下了基礎。
　　 背景：
　　 apoM主要存在于HDL中，在肝臟和腎臟中表達，提示該蛋白與血脂的轉運和代謝有關。最近Xu等發(fā)現(xiàn)血液中apoM濃度與體重指數(shù)(BMI)以及血液中瘦素(Leptin)含量呈正相關，而與血液中總膽固醇呈負相關，但相關機制還未明確。另外，a

14、poM屬于Lipocalin超家族，推測可能與血漿中疏水性生物活性分子的結合、轉運和代謝有關聯(lián)，其確切功能尚有待進一步研究。目前國內定量檢測apoM濃度的方法僅限于半定量的Western印跡和Dot-Blotting法，需要建立標準統(tǒng)一、方法穩(wěn)定、操作簡單的定量檢測方法，這對于臨床研究的深入進行將有極大的幫助。
　　 目的：
　　 建立測定人血漿中apoM濃度的雙抗體夾心法，并對該方法的敏感性、重復性、抗干擾能力等作一評

15、價；并建立該方法的正常人參考范圍；觀察血漿中apoM與血脂之間的相關關系；初步比較正常人與冠心病各組人群之間血漿apoM濃度的變化趨勢。
　　 方法：
　　 用棋盤滴定法選擇包被抗體和酶標抗體的最佳工作濃度；用辣根過氧化物酶標記抗apoM8F12C6抗體；用蛋白稀釋度曲線確定蛋白標準曲線的范圍；用血漿稀釋度曲線確定實驗中人血漿的稀釋倍數(shù)；確定了該方法的最低檢測限，測定批間、內變異及非特異性脂蛋白的干擾，以觀察方法的敏感性

16、和特異性。通過測定124例健康體檢人群血漿apoM的濃度，建立本實驗室的正常參考值范圍。比較穩(wěn)定型心絞痛組(SA)32例和急性冠脈綜合征組(ACS)34例病人與35例健康人群的血漿蛋白濃度，分析apoM在不同人群中的變化趨勢。
　　 結果：
　　 1、根據(jù)重組蛋白制備標準曲線，該方法的線性范圍為31.25～375ng/ml，最低檢測限為11.8ng/ml。批內變異4.32～5.69％；批間變異5.24～5.83％。

17、>　　 2、血漿滴度曲線結果表明，人血漿在1：50到1：400范圍內線性關系良好，取線性范圍中間整數(shù)倍1：200稀釋度，作為實驗中人血漿apoM濃度檢測的最佳稀釋倍數(shù)。
　　 3、不同濃度的脂蛋白apoAI、apoB及Lp(a)對該法干擾小，其測定的吸光度值均低于0.33，在該方法的線性范圍外。
　　 4、該方法的正常參考值范圍為13.15±2.68μg/ml。
　　 5、apoM與TG、TC及LDL-C呈負相

18、關趨勢，但差異并無統(tǒng)計學意義；與HDL-C、HDL-C/TC呈正相關(r=0.336和r=0.345)。
　　 6、兩組冠心病患者血漿apoM濃度(SA組11.02±1.96μg/ml，ACS組10.76±1.32μg/ml)均低于正常對照組(12.83±2.28μg/ml)，但兩組冠心病組之間濃度差異不明顯。
　　 結論：
　　 我們建立了測定人血漿中apoM的濃度的雙抗體夾心法，通過檢測該方法的敏感性、重復性