抗梅毒螺旋體Tp0453基因重組蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：將本室構(gòu)建的含梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)外膜蛋白Tp0453的優(yōu)勢表位（28～288aa）基因的重組表達體在E.coli M15中進行誘導(dǎo)表達，純化表達產(chǎn)物并進行抗原性分析。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，將SP2/0細(xì)胞與經(jīng)重組蛋白Tp0453免疫的小鼠脾細(xì)胞進行融合，篩選抗重組蛋白Tp0453的單克隆抗體(mAb) ，并進行鑒定和純化。用此mAb檢測Tp感染疑似患者的分泌物標(biāo)本，由此確定該mAb的應(yīng)用價值，并為T

2、p感染診斷的研究奠定基礎(chǔ)。 方法： （1）使用鎳親和層析法純化重組蛋白Tp0453。SDS-PAGE和 Western- blot鑒定表達產(chǎn)物。 （2）以復(fù)性后純化的Tp0453重組蛋白免疫BALB/c小鼠，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。 （3）體內(nèi)誘生腹水法制備抗體，用硫酸銨沉淀法對腹水中的mAb進行純化，ELISA法檢測抗體

3、效價，mAb亞類測定試劑盒鑒定mAb的類別，通過細(xì)胞涂片染色鏡檢計數(shù)雜交瘤細(xì)胞株染色體數(shù)目。 （4）間接ELISA和間接熒光免疫試驗（IIF）檢測臨床標(biāo)本及mAb的特異性，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：重組目的基因表達菌在IPTG的誘導(dǎo)下，表達了相對分子量（Mr）約為32kDa的目的蛋白, 目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式存在；經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化獲得了純度在95％以上的重組蛋白；Western-blot檢測其能

4、與Anti-His mAb發(fā)生特異性反應(yīng)；應(yīng)用純化復(fù)性后的重組Tp0453免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)過雜交瘤技術(shù)進行細(xì)胞融合；應(yīng)用ELISA法篩選出了4株分泌抗Tp0453重組蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2F8、8B9、9C6和15B2；Western-blot結(jié)果顯示mAb均能與重組Tp0453很好的結(jié)合。用腹水誘生法大量制備mAb；ELISA檢測4株雜交瘤細(xì)胞誘生腹水中的mAb效價分別為1:25 000、1:8 000

5、、1:50 000和1:10 000；根據(jù)mAb親和常數(shù)公式計算4株雜交瘤細(xì)胞分泌的mAb親和常數(shù)分別為4.12×107M-1，2.73 ×108M-1，4.71× 108M-1和3.64×107M-1；經(jīng)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit 測定，4株雜交瘤細(xì)胞分泌的mAb，2F8為IgG2b,其它3株均為IgG1。4株mAb腹水經(jīng)SDS-PAGE均顯示出一條分子量約為50kDa的重鏈條帶和一

6、條分子量為26kDa的輕鏈條帶。4株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)在90～108范圍內(nèi)變化。IIF和間接ELISA對85份臨床標(biāo)本進行檢測結(jié)果表明自制mAb能與天然抗原結(jié)合，并與鍍銀染色的檢測結(jié)果基本符合。 結(jié)論： （1）篩選出4株穩(wěn)定分泌抗Tp0453 mAb的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒定4株雜交瘤細(xì)胞分泌的mAb均能識別重組Tp0453。 （2）獲得的抗重組Tp0453的mAb均為IgG類抗體，且能識別Tp0453抗原的天然表位