抗組蛋白H4K8cr兔單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、背景：巴豆?；且环N進化高度保守的翻譯后修飾。組蛋白 H4第8位氨基酸賴氨酸巴豆?；℉4K8cr）主要富集在人類體細胞和小鼠雄性生殖細胞中的基因活性轉錄啟動子區(qū)和增強子處。由于受到催化Kcr酶研究的限制，目前關于更多的組蛋白Kcr機制及功能研究仍然很少。開發(fā)針對組蛋白的翻譯后修飾(PTM)抗體是進一步揭示新型表觀遺傳標記在腫瘤發(fā)生、發(fā)展與藥物治療中的作用機理的重要方法。兔單克隆抗體具有親和力高和特異性強的優(yōu)點，更適合PTM類抗體的開發(fā)

2、。目前急需開發(fā)H4K8cr的兔單克隆抗體，以便加快其生物學功能的探索和研究。
　　目的：利用兔單克隆雜交瘤技術和重組抗體技術開發(fā)能應用于免疫印跡、免疫組化和免疫細胞化學的H4K8cr兔單克隆抗體。
　　方法：用人工合成的2段多肽H4K8cr多肽，與鑰孔血藍蛋白（H4K8cr-KLH）交聯(lián)混合免疫4只新西蘭大白兔，獲得最佳免疫效果的兔脾細胞與240E-W2兔骨髓瘤樣細胞株融合，運用間接 ELISA法篩選能分泌anti-H4K8

3、cr抗體雜交瘤細胞株。ELISA陽性的雜交瘤細胞株上清進一步通過Western blot、Peptide array等方法進行特異性驗證。Peptide array特異性最好、Western blot信號最強的一株細胞通過重組表達，超濾濃縮最終得到的抗體通過ELISA、Western Blot、IHC、ICC、Peptide array等方法進行特異性鑒定。
　　結果：初步篩選獲得114株ELISA陽性克隆，20株Western

4、blot陽性克隆，選一株1株Peptide array特異性最好的克隆73號進行重組表達，共獲得2 mL IgG濃度為1.562 mg/mL的抗體。其效價為1：409600（1×100×212）。Western blot檢測人HeLa、小鼠3T3、大鼠C6和PC-12四種細胞均能檢測到11 KD的條帶。IHC和ICC結果顯示anti-H4K8cr染色細胞定位在細胞核。ELISA方法驗證與K8非修飾多肽無交叉反應。Peptide arra