抗-URG11和抗-URG4單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、【背景】urg11（up regulated gene 11）和urg4（up regulated gene 4）是近期發(fā)現(xiàn)的可以被乙肝病毒X（hepatitis B Virus x, HBx）蛋白上調(diào)的兩個(gè)新基因。研究表明urg11 不但可以增強(qiáng)細(xì)胞體外增殖能力、促進(jìn)細(xì)胞在軟瓊脂中非錨定生長(zhǎng)和加快裸鼠體內(nèi)成瘤，而且還可以通過上調(diào)β-連接蛋白（β-catenin）的表達(dá)參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生。Urg4 不僅可以增強(qiáng)細(xì)胞體外增殖能力、促進(jìn)細(xì)胞

2、在軟瓊脂中非錨定生長(zhǎng)和加快裸鼠體內(nèi)成瘤，而且還可以促進(jìn)肝癌的形成和胃癌的發(fā)生。更重要的是urg11 和urg4 聯(lián)合其它新克隆的基因可以提前3年預(yù)警肝癌的發(fā)生。因此，進(jìn)一步研究其功能具有重要的科學(xué)價(jià)值，但目前尚未有可用的針對(duì)URG11 或URG4 的單克隆抗體。 【目的】通過人工合成多肽片段制備抗-URG11 和抗-URG4 單克隆抗體，并對(duì)所制備的單克隆抗體進(jìn)行初步鑒定。 【方法】 （1）根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[1,

3、3]通過人工合成多肽，并將此多肽分別連接鑰孔戚血藍(lán)素（簡(jiǎn)稱：peptide-KLH）或牛血清蛋白（簡(jiǎn)稱：peptide-BSA）； （2）以peptide-KLH作為抗原免疫BALB/c小鼠； （3）取血清效價(jià)大于1： 10000 的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 進(jìn)行融合，以peptide-BSA包被，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)雜瘤細(xì)胞的上清進(jìn)行篩選；陽性孔的雜交瘤細(xì)胞予保留，用有限稀釋法進(jìn)行三

4、次克隆化，得到能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； （4）應(yīng)用所得的雜交瘤細(xì)胞株通過腹腔注射BALB/c小鼠以大量生產(chǎn)單克隆抗體； （5）通過鼠單克隆抗體亞類分型試劑盒鑒定單克隆抗體的亞類，采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）和免疫組化方法證明新制備的單克隆抗體能識(shí)別目的蛋白。 【結(jié)果】 (1) 得到一株能穩(wěn)定分泌抗-URG11 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（3D2）；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法和免疫組

5、化方法證明新制備的抗-URG11 單克隆抗體能識(shí)別天然的URG11；此單克隆抗體的亞類為IgG2a/κ。 (2) 得到一株能穩(wěn)定分泌抗-URG4 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1A8）；其分泌的單克隆抗體的亞類為IgG2a/κ；通過蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化方法證實(shí)新制備的抗-URG4 單克隆抗體能識(shí)別天然的URG4。 【結(jié)論】?jī)芍觌s交瘤細(xì)胞株（3D2 和1A8）都能穩(wěn)定分泌目的單克隆抗體； 蛋白印跡法和免疫組化方法證明