抗EGFR單克隆抗體的制備.pdf

1、目的:表皮生長(zhǎng)因子自分泌途徑是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要途徑之一,在多種實(shí)體瘤中均發(fā)現(xiàn)有EGFR的過表達(dá).通過制備針對(duì)EGFR靶點(diǎn)的單克隆抗體,得到抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗體是目前治療腫瘤的一種新思路.本研究尋找一種可以制備針對(duì)EGFR胞外區(qū)抗體的方式,并獲得一到兩株抗EGFR胞外區(qū)的單克隆抗體.方法:由于EGFR胞外區(qū)分子量較大(約為100kD),故尋找在EGFR胞外區(qū)中對(duì)EGFR與EGF結(jié)合活性起重要作用的區(qū)域-EGFR胞外區(qū)Ⅲ區(qū)作為主要克隆目標(biāo).

2、用基因操作手段將目的片段分別克隆到pA和PET載體中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并摸索其最佳表達(dá)條件.具體來說首先將Ⅲ區(qū)片段插入pA載體,通過改變溫度和培養(yǎng)時(shí)間,研究不同溫度下目的蛋白表達(dá)效果.由于pA載體為分泌型載體,在克隆到的基因片段在實(shí)驗(yàn)條件下不能高表達(dá),即無法得到足夠的分泌型蛋白,故轉(zhuǎn)而用高效表達(dá)包涵體的PET載體進(jìn)行表達(dá).通過改變誘導(dǎo)表達(dá)的IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間來得到適宜的表達(dá)條件;然后將表達(dá)產(chǎn)物通過IMAC柱進(jìn)行親和層析純化,取50ug經(jīng)

3、上述純化后得到的目的蛋白與完全弗氏佐劑1:1混合免疫4到6周齡Balb/c小鼠.經(jīng)二次加強(qiáng)免疫后取小鼠尾血檢測(cè)效價(jià),爾后取效價(jià)較好的小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤按5:1混合,常規(guī)融合制備雜交瘤.接著以純化的目的蛋白為抗原,經(jīng)四輪亞克隆篩選得到針對(duì)EGFR胞外區(qū)Ⅲ區(qū)的單克隆抗體.通過免疫熒光、FACS和免疫組化法來測(cè)定抗體與細(xì)胞的親和活性.結(jié)論:通過克隆EGFR胞外區(qū)三區(qū)基因,并克隆到適宜的表達(dá)載體后,可得到目的基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物.包涵

4、體蛋白具有產(chǎn)量高,便于得到足夠的表達(dá)產(chǎn)物,可表達(dá)蛋白種類的范圍廣泛,不易降解且易于保存的特點(diǎn);包涵體的免疫效果與其它方式免疫效果相比較具有血清抗體效價(jià)高,融合效果好的優(yōu)勢(shì);但由于包涵體蛋白折蛋白折疊構(gòu)象與天然蛋白折疊構(gòu)象存在較大差異,較難篩到針對(duì)天然蛋白(尤其是具有復(fù)雜折疊和高度糖基化的蛋白)的單克隆抗體.本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)53株與目的蛋白有結(jié)合活性的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行免疫篩選(ELISA)后,得到三株對(duì)EGFR陽(yáng)性細(xì)胞具有親和活性的雜交瘤株,