抗A型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備.pdf

1、口蹄疫是口蹄疫病毒引發(fā)的一種人畜共患的烈性傳染病，對(duì)現(xiàn)在的畜牧生產(chǎn)有巨大影響。抗口蹄疫單克隆抗體技術(shù)對(duì)口蹄疫的檢測(cè)，早期預(yù)防等有重要影響，對(duì)研究如何診斷、防治口蹄疫等有重要意義。本研究使用獸用A型口蹄疫滅活疫苗做抗原，免疫健康BALB/c小鼠，讓其體內(nèi)產(chǎn)生抗A型口蹄疫病毒的抗體，通過PEG誘導(dǎo)融合技術(shù)制備出針對(duì)A型口蹄疫病毒的單克隆抗體細(xì)胞株，并針對(duì)雜交細(xì)胞和單克隆抗體的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。為之后研制開發(fā)應(yīng)用型診斷產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。

2、　　1、口蹄疫病毒單克隆抗體制備條件的探索
　　在進(jìn)行正式單克隆抗體制備前，分別對(duì)SP2/0細(xì)胞、飼養(yǎng)細(xì)胞和脾細(xì)胞在完全培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究;對(duì)融合過程中使用的PEG的分子量和濃度進(jìn)行了優(yōu)選;針對(duì)免疫過程中用到的獸用A型口蹄疫滅活疫苗的免疫劑量進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果表明:1）分子量為4000，濃度為50％的PEG的融合率最高;2）免疫注射0.1mL疫苗時(shí)，小鼠血清抗體效價(jià)最好。
　　2、抗A型口蹄疫病毒的單克隆細(xì)

3、胞株的制備，篩選以及克隆化
　　選取健康6-8周齡BALB/c小鼠，每只小鼠經(jīng)過3次腹腔免疫后檢測(cè)血清效價(jià)，在融合前3天，尾靜脈加強(qiáng)免疫;在無菌條件下取出免疫脾細(xì)胞，與SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)HAT條件培養(yǎng)基篩選后，檢測(cè)培養(yǎng)基上清效價(jià)，初步確定陽(yáng)性克隆;將抗體陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)孔通過顯微操作法制備出單克隆細(xì)胞，使用間接ELISA法，測(cè)定獲得的33株單克隆細(xì)胞，根據(jù)OD450nm值，篩選出表達(dá)量較高的細(xì)胞株。結(jié)果表明:1）經(jīng)過三次疫苗注射

4、后，小鼠的抗體效價(jià)達(dá)到1∶25600;2）細(xì)胞融合后，通過HAT培養(yǎng)基的篩選，得到雜交細(xì)胞;3）、經(jīng)過顯微操作技術(shù)，制備得到33株陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，其中3株為高表達(dá)細(xì)胞株:9F3、9F4、10B3。
　　3、抗A型口蹄疫單克隆細(xì)胞株及其抗體的鑒定
　　對(duì)9F3、9F4、10B3的穩(wěn)定性鑒定，結(jié)果顯示:9F3和10B3可以穩(wěn)定表達(dá)，9F3細(xì)胞株效價(jià)較高;以9F3作為鑒定目標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線;測(cè)定染色體數(shù)94條;腹水抗體效價(jià)為1∶2