口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A和3B單克隆抗體的制備及其初步應用.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的以感染牛、豬、羊等偶蹄動物為主的急性、熱性、高度傳染性疫病,嚴重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)、國民經(jīng)濟和人民生活,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須申報的多種動物共患傳染病之一。FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3A蛋白在病毒復制中起重要作用,可作為宿主細胞受小RNA病毒感染的標志,而且3A蛋白與病毒的致病力和宿主范圍

2、有關;3B蛋白在FMDVRNA復制合成時起引物的作用。感染動物體內(nèi)產(chǎn)生高水平的抗3AB蛋白抗體,而在疫苗免疫的動物體內(nèi)基本不產(chǎn)生,因此,通過免疫3AB蛋白制備抗FMDV3AB的單克隆抗體,既為FMD鑒別診斷提供物質(zhì)基礎,又為深入研究3AB蛋白及其相關聯(lián)的蛋白的功能奠定了基礎。
　　 本研究構(gòu)建了重組表達載體pET-30a(+)-FMDV-3AB,并在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了可溶性表達,并利用Ni-NTA親和層析純化3AB,Wes

3、ternblot證實3AB可與FMDVAsia1型的牛陽性血清發(fā)生特異性反應,證實表達的融合蛋白具有較好的抗原性。然后以純化的3AB蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合,用間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞,有限稀釋法進行亞克隆,獲得3株能穩(wěn)定分泌抗3B蛋白和6株能穩(wěn)定分泌抗3A蛋白單抗的雜交瘤細胞,分別命名為1B2、1G8、1E11、4A3、4A4、5C9、5D7、9H9和10D1,并對這9株單抗進行了

4、生物學鑒定。亞類鑒定結(jié)果顯示,182和1E11為IgM,1G8為Ig2a,其余均為IgG1亞類,輕鏈均為κ型。間接免疫熒光試驗結(jié)果表明,這9株單抗均能夠識別FMDV3AB蛋白。用制備的單克隆抗體對分段表達的3AB蛋白進行Westernblot分析,結(jié)合位點分別位于3A的第55aa～70aa、64aa～79aa、130aa～145aa區(qū)段,3B的第17aa～31aa、49aa～63aa和25aa～39aa內(nèi)。利用單抗4A3和1B2株,分析