牛Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白B細胞線性抗原表位鑒定.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-MouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus,FMDV)引起的以感染偶蹄動物為主的急性、熱性、高度傳染性疫病。該病的發(fā)生和流行嚴重危害畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展,造成巨大的經(jīng)濟損失,該病被世界動物衛(wèi)生組織列為必須申報的多種動物共患傳染病之一。多項研究表明檢測3ABC抗體是最可靠的衡量感染與免疫動物的指標。3ABC-ELISA敏感性和特異性最好,是大規(guī)模檢疫動物

2、,區(qū)分疫苗免疫和自然感染的最有效方法。然而,抗3A非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體存在于一些疫苗免疫的動物當中,影響3ABC檢測的特異性。3A非結(jié)構(gòu)蛋白是口蹄疫病毒最重要的非結(jié)構(gòu)蛋白之一,免疫原性最強,能夠刺激機體產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此在前人研究的基礎(chǔ)上,對3A非結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位進行深入研究。
　　 為了鑒定Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細胞線性表位,設(shè)計了15(A1～A15)個覆蓋整個Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的多肽片段

3、,每一個多肽片段合成一對寡核酸片段,經(jīng)磷酸化、退火后插入表達載體pET-32a(+)進行融合表達,經(jīng)Westernblot和ELISA分析表明A8和A11融合蛋白能夠被Asia1型口蹄疫感染血清所識別,鑒定表明A8和A11為Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細胞線性抗原表位區(qū)。為了進一步鑒定Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細胞線性抗原表位,設(shè)計了13個覆蓋A8和A11的多肽片段,分別進行融合表達,表達的13個融合蛋白經(jīng)We

4、sternblot鑒定并將Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細胞線性抗原表位精確定位于A8-3(V90NEYIDKA99)和A11-12-Z7(A109EKNPLE115)。
　　 在鑒定Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的基礎(chǔ)上,利用MEGA4序列分析軟件,對226個不同型FMDV(A、O、C和Asial)的3A非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列進行比對,結(jié)果表明只有第95位Asp發(fā)生置換以外其他氨基酸基本保守。為了進一步驗證A8-

5、3(V90NEYIDKA97),根據(jù)參考序列比對結(jié)果和氨基酸的結(jié)構(gòu)類型、親疏水性和極性構(gòu)建表位突變體A8-3-E(VNEYIEKA)和A8-3-F(VNEYIFKA)。AS-3-E(VNEYIEKA)存在于大多數(shù)FMDV(A、O、C和Asial)血清型中,而AS-3-F(VNEYIFKA)不存在于任何血清型中?；谝訟8-3和A11-12-Z7為抗原建立間接ELISA方法,用于臨床檢測牛血清樣品,能夠區(qū)分出陰陽性。
　　 綜合上