牛Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞線性抗原表位鑒定.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-MouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus,FMDV)引起的以感染偶蹄動(dòng)物為主的急性、熱性、高度傳染性疫病。該病的發(fā)生和流行嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須申報(bào)的多種動(dòng)物共患傳染病之一。多項(xiàng)研究表明檢測3ABC抗體是最可靠的衡量感染與免疫動(dòng)物的指標(biāo)。3ABC-ELISA敏感性和特異性最好,是大規(guī)模檢疫動(dòng)物

2、,區(qū)分疫苗免疫和自然感染的最有效方法。然而,抗3A非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體存在于一些疫苗免疫的動(dòng)物當(dāng)中,影響3ABC檢測的特異性。3A非結(jié)構(gòu)蛋白是口蹄疫病毒最重要的非結(jié)構(gòu)蛋白之一,免疫原性最強(qiáng),能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此在前人研究的基礎(chǔ)上,對(duì)3A非結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位進(jìn)行深入研究。
　　 為了鑒定Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細(xì)胞線性表位,設(shè)計(jì)了15(A1～A15)個(gè)覆蓋整個(gè)Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的多肽片段

3、,每一個(gè)多肽片段合成一對(duì)寡核酸片段,經(jīng)磷酸化、退火后插入表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行融合表達(dá),經(jīng)Westernblot和ELISA分析表明A8和A11融合蛋白能夠被Asia1型口蹄疫感染血清所識(shí)別,鑒定表明A8和A11為Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位區(qū)。為了進(jìn)一步鑒定Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位,設(shè)計(jì)了13個(gè)覆蓋A8和A11的多肽片段,分別進(jìn)行融合表達(dá),表達(dá)的13個(gè)融合蛋白經(jīng)We

4、sternblot鑒定并將Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位精確定位于A8-3(V90NEYIDKA99)和A11-12-Z7(A109EKNPLE115)。
　　 在鑒定Asia1型口蹄疫病毒3A非結(jié)構(gòu)蛋白的基礎(chǔ)上,利用MEGA4序列分析軟件,對(duì)226個(gè)不同型FMDV(A、O、C和Asial)的3A非結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明只有第95位Asp發(fā)生置換以外其他氨基酸基本保守。為了進(jìn)一步驗(yàn)證A8-

5、3(V90NEYIDKA97),根據(jù)參考序列比對(duì)結(jié)果和氨基酸的結(jié)構(gòu)類型、親疏水性和極性構(gòu)建表位突變體A8-3-E(VNEYIEKA)和A8-3-F(VNEYIFKA)。AS-3-E(VNEYIEKA)存在于大多數(shù)FMDV(A、O、C和Asial)血清型中,而AS-3-F(VNEYIFKA)不存在于任何血清型中?；谝訟8-3和A11-12-Z7為抗原建立間接ELISA方法,用于臨床檢測牛血清樣品,能夠區(qū)分出陰陽性。
　　 綜合上